電気泳動のスメアバンド

質問

DNAを電気泳動をしたときに、バンドが一本ではなく、スメアになることがあると思います。スメアバンドは様々なサイズのDNAが存在するために、見かけ上スメアになると思っていたのですが、ほんとうのサイズより遥かに大きなサイズと思われるところまで、スメアなバンドが広がっていたりします。また、スメアなバンドをゲルから回収して再精製して泳動してみると、違ったサイズにでたりすることもあります。
スメアバンドの起こる原因やスメアバンドの正体、また、なにかスメアバンドについての情報など、ご教授よろしくお願いいたします。

回答No.3

hagfish · ベストアンサー

エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート（DNAとRNA）・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
この中での二本鎖の核酸成分は増幅産物・テンプレートDNA・テンプレート中のRNAが二本鎖を形成したもの、プライマー同士が反応したプライマーダマーです。RNAやプライマーダマーは一般的に低分子領域にスメアとして現れます。また、PCR反応液にテンプレートを入れすぎるとこれもまた電気泳動上に現れます。サンプルの状態によってはスメア状に出ることもあります。
それと私がキットといっているのはまさにそのフィルターのことです。おそらく、断片化するのは物理的な影響によるものと思いますが、詳しくは販売している会社に問い合わせてください。いろいろと製品ごとの特性がありそうですから。それと製品によって生成できるサイズが異なりますのでそちらは説明書を読んでください。私はキアゲン派でしたがそんなに大きなサイズのものは生成できなかったと思いますよ。

お礼

丁寧なお答えどうもありがとうございました。いろいろ知識が増えました。大きなサイズの断片を精製する際は、フェノール法などを選択したいと思います。

回答No.4

hagfish

キアゲンのDNA精製カラムの例ですが、生成するDNAサイズによってこのように使い分けます（下のURL参照）。フェノール法でやるのは時間もかかりロスも大きく面倒ですよ。参考までに。

参考URL：

http://www1.qiagen.com/Products/DnaCleanup/DnaCleanupSysChooser.aspx

お礼

hagfishさんURLまで紹介していただきありがとうございました。いろいろ参考になりました。

回答No.2

hagfish

すいません。私はDNAシャッフリングをやったことがないのでサンプルの大きさについてはよくわからずゲルのサイズ・電気泳動時間が推測できませんが、一般に電気泳動はゲルの濃度によって分離できる範囲が決まっています。それ以外のサイズは信頼性がないということです。特にスメアがサンプル口にまで達しているということはかなりの高分子ですのでRNAの可能性は著しく低いですし、高分子DNAならパルスフィールド電気泳動でないと正確にはサイズが出ません。また、高分子のスメアを生成するときにキットを使ってませんよね。キットは生成できるサイズが決まっていますのでそれ以上のDNAサイズではキットのフィルターに通したときに断片化します。

補足

キットとはどのようなものか分かりませんが、DNAの精製にはキットは使用していないと思います。ただしフィルターは使っております。キットは精製できるサイズが決まっているということですが、どの範囲のサイズを一般的に精製できるのでしょうか？またフィルターに通した時に断片化するのは何故でしょうか？
また、実験的にサンプルDNAがゲル穴まで達するぐらい高分子量化しそうにないのですが、PCR反応液中に、DNAの他にエチジウムブロマイド染色した時に染まりそうな物質はありますでしょうか？

回答No.1

hagfish

普通スメアはさまざまなサイズのDNAが存在するために生じる現象ですが、それ以外に存在する場合もあります。たとえば、アプライしたサンプル濃度が濃すぎる場合、ゲルの中でサンプルがスムーズに流れず、スメア状になることがあります。一種の目詰まりをした状態を想像してください。
PCRサンプルの場合、よくあることです。
それともうひとつ考えられることはRNAですかね。染色剤がエチジウムブロマイドの場合、二本鎖を染める染色剤ですからRNAは染色されないとお思いでしょうがRNA同士が水素結合により2本鎖を形成し、スメアバンドととして出てくる場合があります。
さらにはサンプルの保存状態が悪い場合、流すまでの間にサンプルが壊れている場合もあります。
私の意見ですが、スメアの部分を生成するとサイズが変わるということですので1番目の理由が大きく、うまく電気泳動で分離できていないだけではないかと思います。
上記の説明ではこれぐらいしか推測できませんので実験の詳細をもっと詳しく書いてください。サンプル種類、ゲルの種類（アクリルアミド、アガロース、変性、非変性）、電圧などです。

お礼

ご回答ありがとうございました。RNA分子がエチブロで染色されるのはそういう理由だったのですね。実験的でスメアになったのは、DNAシャッフリングの再構築の時です。遺伝子内部に繰り返し配列が存在するためか、タンデムにつながり高分子量化する傾向になりがちだと考えていたのですが、サンプル口付近までスメアなバンドが確認されたので、果たしてここまで高分子量化されるものか疑問に思ったのが始まりでした。ゲルはアガロースで電圧は100Vで行っております。