- 締切済み
Km値の求め方がわからなくてとても困っています。
Km値の求め方がわからなくてとても困っています。 乳酸脱水素酵素活性の測定という実験をしました。 リン酸緩衝液、ピルビン酸ナトリウム、NADH、ネズミの肝臓のホモジネートが入った溶液の吸光度を15秒間ごとに測り、吸光度の減少率(ΔA/min)を求めた。 減少率は0.416でした。 酵素活性(反応速度)は0.02×10^6となりました。 ホモジネートのたんぱく質濃度は1.34 酵素の比活性は14.97でした。 この結果からKm値を求めないといけないんですが、まったく計算の仕方がわかりません。 ラインウェーバーバークのプロットが検索でひっかかるのですが、どの値を使えば求められるかわかりません、 ラインウェーバーバークのプロットで求めることができるのかもわかりません。 どなたか分かる方、教えてください。 お願いします。
- me0919
- お礼率16% (1/6)
- 化学
- 回答数3
- ありがとう数12
- みんなの回答 (3)
- 専門家の回答
みんなの回答
- c80s3xxx
- ベストアンサー率49% (1631/3289)
誰がなんといおうと,その実験結果から Km 値は求められませんし,こうやれば求められるとかいう方法は,基本的に間違いです. もちろん,他の実験からわかっていることを併用していいなら話は別ですが,Vmax がわかっているとかでないとだめですね. Michaelis-Menten 式には,速度と基質濃度を関係づけるためのパラメータが二つあるのです.その二つのパラメータを,ひとつの実験条件だけから決定することは,数学の論理としてありえません. もっとも,それとは別に LDH に Michaelis-Menten 式を使えるのかという根本問題もありますが.一点だけのデータでは,適合性もわからないので,みかけの値にしても Km という値を求めることの根拠もないわけで,そういう意味でも課題設定が無意味かつ不毛です.
- c80s3xxx
- ベストアンサー率49% (1631/3289)
基質濃度一点しか測ってないなら,Km値を計算する方法はありません. 「Km値を求めないといけない」なら,求められるような実験をしなくてはいけませんが,そういう実験をしていないのですから,求めようがありません. 適切な濃度範囲で基質濃度を4~5点以上くらい変えて速度を測っているなら,Lineweaver-Burk プロットなり,Eadie-Hofstee プロットなりで Km 値は求められます.NADH 過剰という条件で,ピルビン酸濃度を変えれば,ピルビン酸に対する Km が求められますが,NADH 過剰という条件を満たしているかどうか担保されていないなら,そこも検討する必要があります. ここまで書いたついでにいうと,解析方法もわからずに実験作業をするのは無意味です.順番が逆です.
- cvaa
- ベストアンサー率42% (16/38)
気質濃度と、反応速度は1点ずつしかわからないんでしょうか??
補足
基質濃度は一点しかわからないです。 ブランクとして基質を入れずに測りましたけど、これは関係ないですよね? 反応速度は減少率から求めたものです。 なので一点だと思います。 減少率は吸光度の減少が一番激しいところで求めました。
関連するQ&A
- Km値の求め方について教えてください。
Km値の求め方について教えてください。 Km値を求める実験ではないと思っていたのですが、 実習レポートの課題としてKm値を求めなさいと言われてしまい、 自分の中で???となってしまいました。 先輩に聞いたところ、最適条件からKm値が求められると言われたんですが、 よく分からないので困っています。 0.1mMリン酸緩衝液2.63ml 100mMピルビン酸ナトリウム0.3ml 10mM NADH0.06ml ホモジネート0.01ml が入った溶液 ホモジネートを入れる前の吸光度は1.045 NADHの濃度は0.17mMと分かる ホモジネートを入れてから15秒ずつ、3分間吸光度を測り続けた この結果から吸光度は減少率は0.416 酵素活性は0.02×10^6 ビュウレット法によりホモジネートのたんぱく質濃度を求めた、 たんぱく質濃度は.35mg/ml 酵素の比活性は14.97 と求められました。 これらの結果からKm値を求めることは可能ですか?
- 締切済み
- 生物学
- 乳酸脱水素酵素の活性測定について
ピルビン酸を基質として乳酸脱水素酵素の働きで乳酸が生じる実験を行いました。 このとき、NADHはNAD+に変化し、NADHがないとこの反応は起きないということがわかりました。 そして横軸を時間、縦軸を吸光度として反応曲線を書いたのですが、時間が経っても、吸光度が0にならないのはなぜなのでしょうか? そして時間が経つと、吸光度の変化が極端に小さくなるのはなぜなのでしょうか?変化が小さくなったのを確認する実験はどんなものがあるのでしょうか? もしわかる方がいれば教えてください。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 化学
- 酵素反応について
度々、申し訳ありません。 酵素の反応速度についての論文を読んでいたところ、ラインウェーバー・バークプロットが、どうしても理解できません。 酵素活性に対抗する基質濃度の逆数プロットをコンピューターで解析したとあり、論文中に出てくるその数値をみるとその研究で述べられている考えにあてはまるのですが、図式の見方を忘れてしまっているので、その論証が正しいのか否かということがわかりません。 詳しく書きますと、2つの異なる濃度の触媒を加え、その酵素活性を調べているのでラインは2本あります。 1つは触媒が少なく、もうひとつは適性濃度です。 基質の濃度は同じで、基質濃度はX軸、酵素反応物をY軸にとっています。 図表では触媒濃度が低いときのラインが上、触媒濃度が高い場合が下になっており、さらにその2本の線は途中で交差しています。 私は触媒濃度が高い方が上に、少ない方は下になるように思うので、どうしても納得がいきません。 このプロットの正しい見方、および交差をしているわけなど教えていただけるとありがたく思います。 よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ミカエリス・メンテン式とラインウィーバー・バークプロット。
ミカエリス・メンテンと、ラインウィーバー・バークプロットは逆数の関係でいいのでしょうか? また、 酵素反応の阻害で、混合阻害が起こったときラインウィーバー・バークプロットはどのように変化するのですか? グラフで言うと、傾きが急になりますか? 分かる方、教えてください!
- 締切済み
- 化学
- 酵素について教えてください。
酵素反応の阻害実験を行い、リン酸緩衝液3ml、NADH2(3.5もl/l)「1.0ml、ウシ心臓由来LDH 以上の混合液にピルビン酸とシュウ酸を加えた時の阻害反応も観察しました。ここでわからないことがあるのですが、ピルビン酸とシュウ酸の阻害反応は、競争阻害でしょうか?非競争阻害でしょうか?おしえてください。おねがいします。
- ベストアンサー
- 化学
- ラインウェーバー・バークの逆数プロットで
ラインウェーバー・バークの逆数プロットで 横軸を右に行く程(基質濃度が薄い程)測定値が正確でない理由に付いて教えて下さい。 もしくはそれらの記載がある参考書等でも良いので教えて下さい。 よろしくお願いします!
- 締切済み
- 生物学
- 生物IIの解糖系のしくみについて教えてください。
生物IIの参考書を読んでいたのですが、解糖系の説明のところがよく分かりません。 (1)なぜグルコースからフルクトース二リン酸になる時に、(2×)ATPが消費されて(2×)ADPになっているのでしょうか?ADPからATPが作られることは理解できるのですが… そして、そのフルクトース二リン酸から(2×)ピルビン酸になる時に、なぜ4×ADPが4×ATPになっているのでしょうか?どこから「4」という数字が出てきたのか分かりません。 (2)「ATPは解糖系でしか作られていないのに、なぜピルビン酸をエタノールや乳酸に変えるのか」という説明の中に、デヒドロゲナーゼ(脱水素酵素)が水素をうばう過程があると書いてありますが、なぜ水素がうばわれるのでしょうか? あと、4つの水素がうばわれると書かれていますがなぜ4つなのでしょうか? (3) (2)の続きで、「もし解糖系だけが進むとNADが不足してしまうので、NADH2の水素をピルビン酸に還元して、NADを再生させる」と書かれていますが、なぜNADH2の水素をピルビン酸に還元するとNADを再生することができるのでしょうか?どういう意味なのか分かりません。 学校で生物IIの授業がなく、自学自習しているのですが分からないところがたくさんあり困っています。 基礎的な質問ばかりで申し訳ありませんが、生物に詳しい方できるだけ詳しく教えていただけると嬉しいです。
- ベストアンサー
- 生物学
- 吸光度測定と酵素活性測定法
化学の実験で乳酸デヒドロゲナーゼを280nm吸光度測定したらほとんど検出できなかったのですが、酵素活性では測定できました。 これは、つまり酵素活性測定法の方が感度が高いということなのでしょうか?また、特異性の高い測定法はどちらなのでしょうか。周囲と話し合ったのですが、 A.酵素活性測定法の方が特異性が高いという側の意見 →酵素は基質特異性があるから、特異性を示すのはこっち B.280nm吸光度測定法の方が特異性が高いという側の意見 →280nmは芳香環をもつ物質に特徴的な吸光度なので、特異性を示すのはこっち という意見がでて、分からなくなってしまいました。ご存知の方がいらっしゃったらアドバイスいただけないでしょうか??宜しくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 化学
補足
Km値を求める実験ではないと思っていたのですが、 実習レポートの課題としてKm値を求めなさいと言われてしまい、 自分の中で???となってしまったんです。 先輩に聞いたところ、最適条件からKm値が求められると言われたんですが、 よく分からないので困っています。 0.1mMリン酸緩衝液2.63ml 100mMピルビン酸ナトリウム0.3ml 10mM NADH0.06ml ホモジネート0.01ml ホモジネートを入れる前の吸光度は1.045 NADHの濃度は0.17mMと分かる ホモジネートを入れてから15秒ずつ、3分間吸光度を測り続けた この結果から吸光度は減少率は0.416 酵素活性は0.02×10^6 ビュウレット法によりホモジネートのたんぱく質濃度を求めた、 たんぱく質濃度は.35mg/ml 酵素の比活性は14.97 と求められました。 これらの結果からKm値を求めることはやっぱり不可能なことですか?