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Ligation時に使用する試薬の量と計算方法は？
- Ligation時に使用する試薬の量について、Distiled Waterを21 μlにし、Ligation Bufferを2 μl、Vectorを1 μl、T4 Ligaseを1 μl加える必要があります。
- Insertの量は濃度に依存します。
- 分子生物学的なテクニックを学ぶための良いサイトや本についての情報を教えてください。
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今手元にノートがないのではっきりとは分かりませんが、記憶を元に。 たしかライゲーションはInsertをVectorのモル数（分子数）の３倍量加えて反応するはず。 だとすると計算式は、 Insertのモル数＝Vectorのモル数×３ また、ＤＮＡのモル数は重さ（質量）／長さに比例するはずなので、これを使うと、 Insertの重さ／Insertの長さ＝（Vectorの重さ／Vectorの長さ）×３ さらにＤＮＡの重さは濃度×体積（μｌ）なので、 （Insertの濃度×Insertの体積）／Insertの長さ ＝｛（Vectorの濃度×Vectorの体積）／Vectorの長さ｝×３ このままだと計算しにくいので使うときは式を変形して計算するんだったと思います。 でも変形しちゃうとわけがわかんなくなっちゃいますよね。 この計算式でRUSASさんの場合を計算してみると、 Insertの量は２μｌ加えればいいんじゃないでしょうか？ 僕がうろ覚えな言い訳をさせてもらうと、僕は普段Ligationするときは事前にInsertを１μｌほどゲルに流し、よく見えたら１μｌ、よく見えなかったら２μｌをLigationに使うようにしています。 まあ、先輩の指示でそうしてるだけなんですが、それでけっこううまくいきますよ。 うまくいかない場合は、Insertの量よりもInsertの質の影響の場合が多いので、もう一度精製したほうがいいみたいです。 短い経験からのアドバイスでした。
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- overthisgraysky
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＃２の補足です。 Ligationのあとに大腸菌にTransformationしますよね？ そのときコロニーがほとんど出ていなかったら、ＤＮＡ以外のものが邪魔してると思うのでエタノール沈殿をすればいいかも知れません。 でも多いのは、コロニーはたくさん出ているのにみんなネガティブなときです。 この場合は別のＤＮＡが混ざっててそっちの方がライゲーションしているので、ゲルに一度流して目的のバンドを切り出して回収するとうまくいったりします。（ＱＩＡＧＥＮのキットなど。もしこの方法でInsertを作っていたならやり直しということ。） ゲルに流すときはインサートの長さにあわせてゲルのAgarose濃度を変えて、できるだけ目的のＤＮＡのバンドが他のＤＮＡのバンドから遠くなるようにするといいです。 以上。また自信があんまりなくてごめんなさい。
お礼
こんにちは。再び回答ありがとうございます。 コロニーはたくさん得られていますが、全てnegativeです・・。Vectorにはlac Z geneがあるので青/白セレクションをして、白色のコロニーを選んでいるのに得られるバンドはコントロール（Vectorのみを流したもの）と同じ位置、即ちno insertのものばかりです。 Agaroseの濃度は普段0.8%を使っています。濃度の調節はどのようにすればいいのでしょうか？insertが大きい場合は濃くするのですか？薄くするのですか？因みに今回のinsertの大きさは約1Kbです。
- Grace-Wonder
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下記のサイトに詳しく載っています。 http://bio.takara.co.jp/catalog/Catalog_d.asp?C_ID=C0283
お礼
ありがとうございました。参考にさせていただきます。もう少し私自身も勉強が必要かと思いました。
お礼
丁寧な解説ありがとうございました。大いに参考にさせていただきます。 実を言いますと、Insertの量は結構いい加減にやっていました。それでも今までは何とかなっていたのですが、近頃はそれにも限界を感じ、この場を借りて質問させていただきました。 さらに質問になりますが、精製というのはEthanol Precipitationをすればいいのでしょうか？