パラフィンブロックの切片

質問

いまさら、で、かつこんなところで聞くのもすみません、という感じなんですが、本当に困っております。どうかどなたかお教えください。

パラフィンブロックをマイクロトームで５ないし7umで（脳切片）切り落としているんですが、最近だんだん切片がしろくなるようになりました。以前はあたたかいお湯の上に（何度だったかわかりません、waterbathをメモリで覚えていたのが問題でした）のせてスライドですくってそのままお湯を切るためにしばらく立てかけておいてあとは37度で一晩おいていました。それでおおむね良かったのですが、それも時々は白くなっていました。
最近久しぶりに切り始めたのですが50度の湯浴にうかべて（これがあついのかすぐに割れ始めたりパラフィンがこなごなにきたなく分離するので40度くらいのお湯にかえてみて、サンプルはよくのびて溶けすぎるのはなくなりました）、そのあとすくって放置するのですがすぐに白ーく粉吹き団子のようなしろい切片になるのです。５６度のホットプレートでもう一度とかしたりしているのですがそのあとひやすとやっぱり白いようです。いったいどういう条件が切片を白くさせるのかわかりません。どなたかご教示ください。
　また、ブロックを切るときに切片が二つ三つと別れて、ときにはたこの足かシュレッダーかさえ思うような感じに切れてしまいます。どうやってこれを回避すればいいのかわかりません。余分なパラフィン部を削ったり、冷やしたり（これでいいこともありますが脳は冷やさない方がいいとも言われた事もあります）、息を吹きかけたり（これも結構いいときもあります）、と言われた事はやっているのですが、ブロックの四角い面が全部おおむねつながって切り落とされる事がありません。つながってさえいれば、しわしわでもくるくるでも問題ないのですがいつもばらばらなので最近閉口しています。どなたかご教示を。
　最後に、静電気がひどくてたこ足切片をピンセットではじをつかもうならあっというまに切片がひっくり返ってまとわりつきこれも困ってます。静電気についてご存知の方、なにかお知恵を。

回答No.3

otx

切片中の組織のところが白くなるということは、私も経験あります。
しかし、前回の回答のとおり、
切り方が悪いか、固定や包埋時における組織の状態が原因であることが多いです。
特に、包埋時に組織にパラフィンが十分浸透していないとなりやすい気がします。
大きい組織の時にはパラフィンにつけておく時間を注意する必要があるように思います。

また、仮に白くなったとして、その切片を脱パラ→加水するとどうなるのでしょうか？
私もたまに乾燥させると白くなる組織に出会いますが、加水して組織を見ると問題なく、また免疫染色等も問題ないこともあります。

回答No.2

otx

すべての現象の原因は「切片がうまく切れていない」ことに起因すると思います。

ゼリーを凍らせたことはありますか？それを包丁で切るところを想像して下さい。
カッチンカチンのやつを包丁で切ると、ジャリジャリと切れると思います。そうなると、それは切片ではなく、粉々に砕けたものが集まっているものです。
おそらく質問者様の切片はそういう状態で、乾燥すると風化し白くなっていると思います。
それよりも状態が悪い時に、シュレッダーのようになっていると思います。

ということで、「うまく切れていない」のだと思います。

経験上、冷やすのと余分なパラフィン部分を削るのは逆効果に思います。
むしろ少し暖めると切れやすいです。（パラフィンが解けない程度、私は37℃のインキュベータにしばらく入れたりします）
息を吹きかけるといい時もあるとありますが、このことからも暖めることがいいと分かると思います。
このことを利用して、霧吹きみたいなやつで暖かい蒸気をあてる器具が売ってあるくらいです。そういう理由で冬は切りにくいです。
私は室温を暖房であげて、カッターの部分も少し暖めて切り始めます。

また、余分な部分のパラフィンをそぎ落とすとだめというのは、
余分な部分のパラフィンを切る勢いて組織も切るという雰囲気というか、
組織をその余分なパラフィンが支持するという感じというか、
経験上、ある程度の余分な部分は必要に思います。

そして、ブロックを切るときの刃ですが、これはきちんとセッティングしなければなりません。角度や新しさ、これはうまくこの場では説明できません。使われている器具にもよりますし。

あと、組織の固定、包埋のときにうまくやっていないと、組織が固くなりすぎて切るのが大変ということもあります。これは前述のカッチカチに固まったゼリーを切る時と同じような感じです。

最後に

切片を切るということは、ある意味職人芸です。これで問題解決という条件よりも、自らが培った経験と技量によるところが多いと思います。
私はうまくなるまで、切片を切りまくりました。練習をしました。
そういう努力が重要かと思います。

補足

御教示ありがとうございます。ブレードは使い捨てでマイクロトームで切り始めた当初はおおむねうまく切れてました。切れ具合にかかわらず白くなることはなかったのでブレードや切れ具合が白くなる原因かどうか今でも疑問です。今日はおっしゃる通り冷やすのはやめて霧吹きがないので濡れたガーゼでサンプル表面をかるく拭ってから切ってみました。加えてブロックの切り始めの一片の角にそって爪の「背中」でかるくなぞってみました。さらにひきつづく組織でないパラフィン部分にも同じように爪の「背中」で平行に傷をつける感じで数本こすりあとをつけてみました。結果は素晴らしいことに全く割れなくなりました。うれしくて叫びそうでした。とにかくありがとうございました。あとは白くなるのが問題なんです。

回答No.1

wacky4

接着剤のようなものは用いないのでしょうか。30年以上前私が大学生だったときは，卵白を水で薄めたもの(アルブメン)を使っていたような気がします。卒業後は行っていないので，今では時代遅れになっているのかもしれないのですが，原理的には同じではないかと思います。スライドガラスに切片がはりつけば，粉っぽくはならないと思います。
　切片が割れるのを防ぐには，パラフィンを柔らかくするもの(ラノリンだったか何だったか忘れました)を，室温に応じて加えればよいと思われます。それと，試料の脱水が不十分だと割れるかもしれませんので包埋する前の試料の脱水をきちんと行う必要があるかもしれません。

補足

おっしゃっているのはスライドグラスの貼り付けが悪いのではないかということですね。今はシランコートグラスやMASコートなどの貼りつきのよいものがつかわれているのでその点は問題ないかもしれません。ちなみにアメリカというかここNIHではこれらがなくてプラスに電気的にチャージされたチャージグラスがほとんどメインのようです。もっとも前述のコートも原理的にはこの電気的な側面があるようです、、、。しかしそれでも僕のがうまく張り付いているかどうかは別問題ですね。シランコードグラスもためしてみます。「割れ」の問題ですがご指摘のようにパラフィンを柔らかくするという思いで濡れたガーゼでサンプルをふいたあとに切ってみたところ「割れ」は完璧になくなりました。ブロックは私が作ったのではないので？ですがきちんとしたcompanyあるいはinstituteで作られているものとおもうのですが。。。