- 締切済み
ポジティブ-ネガティブ選択法??
現在、大学で遺伝子関連の授業を受けているものです。 そこで外来遺伝子導入について学んだのですが相同遺伝子領域の挟まれたとこ(?)にネオマイシン耐性遺伝子を、その最端部位にチミジンキナーゼの遺伝子配列を組み込みます。次に外来遺伝子を導入するのですが相同組換えと非相同組換えの2通りが考えられると習いました。しかしこの後どういう流れでポジティブ、ネガティブ選択という意味になるのかが理解できません。 GCV(ガンシクロビル)はチミジンキナーゼによってリン酸化されると毒性を示すのはかろうじてわかります。 見当違いな質問かもしれませんが、詳しく教えていただけたら助かります。どうかお願いします。
- cena111620
- お礼率0% (0/2)
- 生物学
- 回答数2
- ありがとう数10
- みんなの回答 (2)
- 専門家の回答
みんなの回答
- bZx65Ybj
- ベストアンサー率0% (0/0)
ポジティブ-なかったら死ぬ ネガティブ-あったら死ぬ
- stringf35
- ベストアンサー率66% (69/104)
ものすごく教科書的な話ですね…。 おそらく外来遺伝子導入というより、ノックアウトマウス作製などに用いられる ジーンターゲティングの話をされているのだと思います。 相同組み換えが成功した場合には、ネオマイシン耐性遺伝子のみが導入され、 相同配列の外側にあるチミジンキナーゼ(TK)遺伝子配列は導入されません。 なので、導入された細胞は、G418などのネオマイシンを含有している培地で生きられます。 また、TKは組み込まれませんので、GCV含有培地でも生きられます。 一方、非相同的にゲノムにinsertionが起きた場合には、ネオマイシン耐性遺伝子と TK遺伝子の両方がゲノムに組み込まれます。 この細胞は、ネオマイシン含有培地では生きられますが、GCV含有培地では生きられません。 よって、細胞にターゲティングに用いる配列を導入した後に、まずネオマイシン含有培地で培養し、 遺伝子導入が成功した細胞をセレクションします(このとき相同組み換えか非相同組み換えかは無関係です) ネオマイシン耐性遺伝子が導入された細胞を選択するので、ポジティブセレクションといいます。 次に、GCV含有培地で培養すると、相同組み換えが成功した細胞のみが生き残ってきます。 TK遺伝子が導入されなかった細胞を選択するので、ネガティブセレクションといいます。 ノックアウトやノックインを可能にした美しい手法ですので、教科書でじっくり勉強してみてください。
関連するQ&A
- 非相同組換えについて
ターゲティングベクターと標的遺伝子が相同領域で相同組換えをする事と、そのチェックとしてネオマイシン耐性遺伝子の役割は理解できたのですが 非相同組換えが理解できません。 相同よりも、非相同組換えの方が頻度が多い事、そもそも非相同領域で組換えが起きるという事がイメージできません。またベクターの後ろのチミジンキナーゼが非相同だと入ってしまうのかもわかりません。 教えてください。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 生物 連鎖地図(染色体地図)の実験法
生物の連鎖地図の実験方法(↓)がよくわかりません。 <手順> (1)連鎖の有無を調べる。同じ連鎖群に属する形質の遺伝子は、同じ相同染色体上にある。 (2)同じ連鎖群に属する3対の形質について交雑を行い、組み換え価を計算する。 (3)組み換え価が遺伝子間の距離に比例するとして、遺伝子の配列を決める。 (4)(2)と(3)を繰り返して、連鎖群全体の遺伝子の配列を決める。 (5)染色体の構造を考えて補正する。 特に(1)「同じ連鎖群に~相同染色体上にある」がひっかかります。 あと、どうして調べるのは3つの遺伝子間なのですか? それと連鎖している2つの遺伝子間では距離が遠くなるほど組み換えは起こりやすくなることから、組み換え価は2つの遺伝子間の距離に比例している、と考えられるのはどうしてでしょうか? 質問攻めの文章ですが回答よろしくお願いします。m(_)m
- 締切済み
- 生物学
- ES細胞を使用したキメラマウスの作成に関して
培養ES細胞に操作して作った変異遺伝子のDNAを導入して、相同組換えを起こした培養ES細胞のみを選別して、マウスの胚盤胞に導入してキメラマウスを作る方法に関してご質問させていただきます。 培養ES細胞に起こった相同組換えは一対の標的遺伝子のうちの片方である(仮に起こったとして)と思うのですが、相同組換えを起こしていない方の標的遺伝子が発現することはないのでしょうか。 調べた限りでは相同組換えを起こした(ネオマイシンなどで)培養ES細胞を導入すれば必ず変異が現れるようです。 これは相同組換えが起こった標的遺伝子のほうが起こしていない相同な標的遺伝子よりも優性であるからでしょうか? 未熟な知識での書き込みのため、誤りがあるかもしれませんが、よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ターゲティングベクターについて
ノックアウトマウスの、ターゲティングベクターを作る際に、 片方の相同領域を短くする理由は何ですか? またネオマイシン耐性遺伝子の向きが正方向で作成したもの、逆方向で作成したものがあるのですがこれはどうしてですか?教えてください。よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- ノックアウトマウスの作成について
生物学を勉強している学生です。 ノックアウトマウス作成に関して質問させて下さい。 問題文に、標的遺伝子を破壊する際、ネオマイシン耐性遺伝子を挿入する。 その際、標的遺伝子のプロモーターは削除しておくとあります。 そして設問は「標的遺伝子のプロモーターを削除する理由を述べよ」です。 理由が、全く分かりません。 解答を見てみたのですが、非相同組換え体をネオマイシンで排除する事に関する説明がされているだけで どうしてそれがこの設問に対する解答になるのか、いまいちピンときません。 どなたか、お力添えを頂けないでしょうか。。? よろしくお願いいたします。
- 締切済み
- 生物学
- 抗生物質を用いた安定発現株に関して
よくネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドをリポフェクションによって細胞に導入し、ネオマイシンによってセレクションを行って安定発現株を得ると言う実験が行われていると思います。 この安定発現株って、細胞がプラスミドをプラスミドの形で安定に保持し続けているんでしょうか? それとも染色体内に組込まれて保持されているものなんでしょうか? 調べてみたけどよくわからなかったので、どうか教えて下さい。
- 締切済み
- 生物学
- 遺伝子組み換え技術の破壊株作成法について
私は実験で細胞性粘菌を使用して特定の遺伝子破壊株を作成しています 方法としては相同組み換えさせるために必要なノックアウトコンストラクト(人工構築物) を作成し、エレクトロポレーション(電気穿孔法)で細胞に導入しています ほかの生物でもノックアウトコンストラクトは使うと思うのですが どうやって組み換えをおこされているのでしょう? マウス等では受精卵にいれて組み替えているんでしょうか? 方法等知っている方、教えてください
- ベストアンサー
- 生物学
- G418の濃度(セレクション)
これからネオマイシン耐性のプラスミドを導入してセレクションを行うために、プラスミド導入前の細胞がどの程度のG418濃度でアポトーシスが誘導される検討を行っているのですが、力価として3000 μg/mLまで濃度を上げましたが全然死んでくれません。 細胞は株化された血管内皮細胞なんですが、wakoの試薬情報では哺乳系細胞では100~2000 μg/mLとなっています。 今後、G418濃度を上げ続けてセレクションするのがよいのか、それともいっそのこと耐性遺伝子を変えてしまうのがよいのか迷っています。 どなたかアドバイスよろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 毒素の自己耐性機構
自然界にはクモ、サソリ、カエルなど自己防衛のために毒素を有しています。これらの毒素に対する自己耐性機構に興味を持って調べております。例えば、フグ毒のテトロドトキシンに対してはフグやイモリ、ヘビなどはその標的であるナトリウムチャネルのアミノ酸配列を変異させることにより自己耐性を行っていますし、藍藻が産生するサキシトキシンに対してはその生合成遺伝子クラスター中に薬物排出遺伝子を有してサキシトキシンを自己排出を行い、サキシトキシンに対する自己耐性を確保しています。 そこで質問ですが、イモガイのコノトキシンや毒蜘蛛の神経毒素、サソリ毒素などは他の動物に対しては毒性を示し、自己に対しては耐性を示す機構を教えてください。 また、これらのことに関してまとまった書物があれば教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学