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CREB発現ベクター
レポーター遺伝子を用いて転写活性を測定しているのですが、その際にclontech社のp-CMV CREBというプラスミドを同時に過剰発現させています。 しかし、あまり効果が見られず一体どうしたことかと思っております。 何か情報をお持ちの方、または実際に使用されている方の感想などお聞きできればと思っております。
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- Grace-Wonder
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全体の細胞系、アッセイ系やコンストラクトを特定していただけると良いのですが…。 CREBはリン酸化の状態などによっても、反応性が異なってきますので、CRE reporter系などで見てるのであれば、細胞を変えてみたりするのも一手です。 cAMPなどでキチンと応答が見られる系なのでしょうか？？ 補足お願いします。
補足
アッセイ系としましてはpGL3 vectorを用いたルシフェラーゼ活性の測定によるもので、細胞はrat-cortical neuronのprimaryです。 CREレポーター(stratagene)も用いたのですが、やはりそれほどの活性上昇は認められず・・・フォルスコリンのような活性化剤はある遺伝子での活性上昇は認めていますのでcAMP系のシグナルは働いています。 少し思うのですが、転写因子の過剰発現というのはどの程度の活性変化が見られるのでしょう。転写因子余剰の場合、シグナルによる活性化（率）というのは相対的に減ってしまうんじゃないかなと最近危惧しています。
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補足
FuGENEは使っていません。実は手前どもで調整している試薬を使ったリン酸Ca法です。これでCo-transfection以外の転写活性化は十分見られるんです。ちょっとした我が研究室の誇りだそうです・・・ CREBのリン酸化についてなんですが、全くその通りでCREBのリン酸化は１時間程度で低下しました。しかし、あるCREB依存的に働くプロモーターの活性はその系を用いているにもかかわらず刺激後９時間に活性のピークが出現します。まさに「なんでだろ～」の世界です。