免疫染色の方法について（モノクローナル抗体の場合？）

質問

マウスを用いて免疫系関連の研究をしている修士2年です。研究室3年目にして恥ずかしいのですが質問です。

現在、ある内分泌器官を、DABを用いた酵素抗体法（ABC法）で染めて、あるペプチドを産生している細胞の頻度及び分布を調べようと思っています。用意した物とプロトコルは以下です。
・組織サンプル（ブアン固定→パラフィン包埋→4μm切片）
・Elite ABC kit（内容：Blocking用Goat血清、biotin結合2次抗体、ABC溶液）
・1次抗体（Rabbit anti-（そのペプチド）antibody）
プロトコル・・・通常の脱パラ、浸水化、抗原賦活化（一応）、内因性ペロキシダーゼ除去→kitのプロトコル（1次抗体は4℃o/n）

この1次抗体は、ある先生に紹介されて知り合った他大のA教授に分与していただいたものです。A教授とは直接お会いしたことはなく、メールや参考文献も自分の指導教官であるB教授を通して受け取っています。A教授はこの1次抗体を自分で作成（既知のアミノ酸配列からペプチドを合成→ウサギに投与→血清から精製）して、その抗体を用いた染色で論文を沢山出しているような方です。その論文を参考にして、今回のプロトコルを組んで染色してみたのですが、全然うまくいきません。組織内の細胞がところどころポツポツ染まるはずなのに、赤血球と血管内皮細胞以外の組織細胞全部がベッタリと染まってしまうのです。A教授の染色で私の染色と異なる点は、動物がラットであること（問題のペプチドは両種で保存されていることが分かっている）、kitを使っていないこと（ABC法ではなくPAP法、発色は同じくDAB）のみです。

こんなことはA教授に聞けばいいのですが、うちのB教授は少々プライドが高いところがあって難しそうなのです。それに、B教授はもともと免疫染色が得意ではないようです。B教授は今のベッタリ染色像が正しい染色像だと思っていて、このまま私の論文まで持っていくつもりみたいですが、色々な参考文献を見ている私としては、このベッタリ具合は絶対何かおかしいのです。（でもB教授は私の意見はお構いなしです(ノд・。) ）だって本当は、下垂体のACTH細胞くらいくっきり染め分けることが出来る抗体なんです。先入観を差し引いても、ラットとマウスでこんなに違うとは到底思えません。

さて、長々と読んでいただいてありがとうございます。。。質問は以下です。
1．私の染色方法やkitで、「もしかしてここのミスかも・・・」と気になる点があったら教えてください。（モノクローナル抗体を使った染色にはもともと不慣れです。）
2．指導教官であるB教授に「待った！」をかけるために、いい策はないでしょうか？？？（この質問に関してはカテ違いかもしれませんが・・・。）

回答No.1

geneticist12

１．一次抗体のみ省いた、ネガティブコントロールの結果はどうでしたか。非特異的な染色がみられる場合、一次抗体の非特異的な結合による場合もありますが、二次抗体以降の非特異的反応が原因であることが少なくありません。
もし、このネガコンでも同じように染まるなら、見えている染色は標的タンパク質の分布を反映していないことになり、「今のベッタリ染色像が正しい染色像だ」というのは否定できます。

２．標的組織はなんでしょうか（マウスかラットかは別として、A教授がやっているのと同じですか？）。組織によっては免疫グロブリンが（Fc領域を介して）非特異的に結合する場合があります。

3. 供与先のプロトコールらしきもの詳しく書かれていますが、肝心の実際に行った方法（ブロッキング、二次抗体などの情報）がないので、気になる点はといわれても答えにくいです。

それと、ウサギ抗血清から精製した抗体はポリクロですね（モノクロはハイブリドーマで作る、一次構造から同一で多様性のない抗体。ポリクロは同じ抗原を認識する多様な抗体を含む）。

お礼

大変参考になりました。
どうもありがとうございました。
お礼が遅くなり、大変失礼いたしました。

補足

失礼いたしました。言われてみると穴だらけの書き込みでした。
1．ネガコンでは、1次抗体を加えない限り、組織内の細胞は全然染まりません。1次抗体以外全部同じプロトコルで同時にやっても、です。
2．標的組織は、A教授、私たち共に下垂体です。（研究室を特定されるのが怖くて書きませんでした。苦笑）
3．詳しく書いたほうのプロトコルは、私が実際行っているものです。分かりづらかったですが、ABC法を用いたのが私、PAP法を用いたのがA教授です。より詳しく書くとこうです。
(1)定法により脱パラ（キシレン→EtOH系列）、浸水化（流水10分）。
(2)抗原賦活化液（0.01Mクエン酸ナトリウム緩衝液 pH7.0）中で121度20分加熱。流水10分。
(3)内因性ペロキシダーゼ除去（0.1%過酸化水素水30分）。wash×2
(4)FcRのBlocking（Elite ABC kit内のもの、30分）。wash×3
(5)1次抗体（A教授の使用濃度にて、4℃、overnight）。wash×3
(6)2次抗体（Elite ABC kit内のもの、1時間）。wash×3
(7)ABC（Elite ABC kit内のもの、1時間）。wash×3
(8)DAB発色液（0.2mg/ml DAB in 0.05M Tris buffer pH7.6、20分程度）。
あとは必要に応じてヘマトキシリンでcounter stainして、封入です。
・wash・・・PBS5分。
・記載のない場合室温にて処理。
・抗体は全て2％FCS-PBS（0.02％アザイド加）にて希釈
・kitはこれです↓
https://search.funakoshi.co.jp/fsearch/ProductInfo.jsp

それと、失礼しました( - -)汗、血清から精製と書きましたが誤りでした。（自分のとこの抗体精製と混同してました。）多分普通にB cell精製して取ってきたはずなので、モノクロが正解です。

それと追加情報ですが、このベッタリ染色像は核の中まで染まってます。しかも、ヘマトキシリンを入れると、ヘマトキシリンだけで染まる（つまりDABは結合していない）ような核もところどころにあるのです。いったい全体これは・・・。
なんだかこの質問締め切って仕切りなおしたほうがいい感じですかね・・・。（もうすこし待ってみますが。）質問が下手で申し訳ないです。