免疫染色の方法について（モノクローナル抗体の場合？）

質問

マウスを用いて免疫系関連の研究をしている修士2年です。研究室3年目にして恥ずかしいのですが質問です。

現在、ある内分泌器官を、DABを用いた酵素抗体法（ABC法）で染めて、あるペプチドを産生している細胞の頻度及び分布を調べようと思っています。用意した物とプロトコルは以下です。
・組織サンプル（ブアン固定→パラフィン包埋→4μm切片）
・Elite ABC kit（内容：Blocking用Goat血清、biotin結合2次抗体、ABC溶液）
・1次抗体（Rabbit anti-（そのペプチド）antibody）
プロトコル・・・通常の脱パラ、浸水化、抗原賦活化（一応）、内因性ペロキシダーゼ除去→kitのプロトコル（1次抗体は4℃o/n）

この1次抗体は、ある先生に紹介されて知り合った他大のA教授に分与していただいたものです。A教授とは直接お会いしたことはなく、メールや参考文献も自分の指導教官であるB教授を通して受け取っています。A教授はこの1次抗体を自分で作成（既知のアミノ酸配列からペプチドを合成→ウサギに投与→血清から精製）して、その抗体を用いた染色で論文を沢山出しているような方です。その論文を参考にして、今回のプロトコルを組んで染色してみたのですが、全然うまくいきません。組織内の細胞がところどころポツポツ染まるはずなのに、赤血球と血管内皮細胞以外の組織細胞全部がベッタリと染まってしまうのです。A教授の染色で私の染色と異なる点は、動物がラットであること（問題のペプチドは両種で保存されていることが分かっている）、kitを使っていないこと（ABC法ではなくPAP法、発色は同じくDAB）のみです。

こんなことはA教授に聞けばいいのですが、うちのB教授は少々プライドが高いところがあって難しそうなのです。それに、B教授はもともと免疫染色が得意ではないようです。B教授は今のベッタリ染色像が正しい染色像だと思っていて、このまま私の論文まで持っていくつもりみたいですが、色々な参考文献を見ている私としては、このベッタリ具合は絶対何かおかしいのです。（でもB教授は私の意見はお構いなしです(ノд・。) ）だって本当は、下垂体のACTH細胞くらいくっきり染め分けることが出来る抗体なんです。先入観を差し引いても、ラットとマウスでこんなに違うとは到底思えません。

さて、長々と読んでいただいてありがとうございます。。。質問は以下です。
1．私の染色方法やkitで、「もしかしてここのミスかも・・・」と気になる点があったら教えてください。（モノクローナル抗体を使った染色にはもともと不慣れです。）
2．指導教官であるB教授に「待った！」をかけるために、いい策はないでしょうか？？？（この質問に関してはカテ違いかもしれませんが・・・。）

回答No.2

wriwri

前の方も質問されていましたが、質問者さんは抗体がポリかモノか解っていらっしゃらないようです。まず、そこをはっきりさせないと正しい二次抗体を使っていらっしゃるかどうか不明です。

全て正しい抗体の組み合わせで実験が行われているという条件でお話いたします。どうやら、質問者さんが見ている像は非特異的な反応のようですので、以下のことを検討されたら如何でしょう。

１）抗体は使用直前に１４０００ｒｐｍで遠心すること：抗体はアグることが多いですので、前もってそれを取り除くことが必要です。

２）抗体の濃度の検討：一次と二次抗体の組み合わせを可能な限り検討することも必要と思います。また、一次抗体のコントロールはＮｏｒｍａｌラビットＩｇＧあるいはＩｓｏ－ｔｙｐｅ　ｍａｔｃｈｅｄマウスＩｇＧになります。

３）一次抗体の特異性：ＩＨＣで使える抗体であるならば多くの場合ウエスタンでも使えます。もし、目的の抗原を発現している細胞が入手可能なのであれば、ウェスタンで抗体の特異性を確認したらいかがでしょう。

他にも細かいことを言ったらきりがありませんが、このような実験の場合一つ一つの事項を丁寧に検討してください。二次抗体を入手したメーカー、あるいはそのロット番号までがその検討の対象になります。

お礼

補足も含めお礼させていただきます。

まず、1次抗体は絶対にモノクローナル抗体です。A教授が送ってきた資料の中にそれがモノクローナル抗体であることが明記してあるというのが一番端的な証拠です。
また、自分の経験としては、同じRabbitのmAbとして、Rabbit抗ACTH抗体を用いて今回と同じ組織の切片を染色したことがあります。（逆に言うとそれくらいしか経験がありません…）その染色では、よく論文上で目にするような典型的な組織像を得ることが出来ました。それに対し今回の抗体ではうまくいきません。
もともと医学部などとは違い貧乏な研究室ですので、2次抗体を色々試してみるということに対して、B教授は否定的です。ですが、抗ACTH抗体を用いた染色の際には、IHCとIFを両方試した経緯があります。そのおかげで今手元にFITC-抗Rabbit IgG抗体があるので、そちらで一度試してみようかと思っているところです。その他に、

1)抗体は使用直前に14000rpmで遠心してみる

2)抗体の濃度を再検討してみる（二次抗体はこれまであまり振っていませんでしたので…）。また、一次抗体のコントロールはvehicle（2%FCS-PBS）を用いていましたので、Normal Rabbit IgGかIso-type matchedマウスIgGがないか、ちょっとディープフリーザーを漁ってみようと思います。（前述のACTH染色ではBackgroundがほとんどないので、一応大丈夫だとは思いますが…これからこの抗体のためにさらに条件を振っていった際には、それはそれでしっかりしたcontrolが必要ですよね…。）

3)笑われるかもしれませんがうちの研究室ではblottingの系は全く扱っていません。論文を出す上で必要になった時に、医学部など他の研究室の手を借りている状態です。確かに今回のようなケースでは、本来ならいただいた抗体の特異性を自分の研究室でも確認する必要があるのかもしれません。今後上記1)2)を試してもどうしても染まってこない場合は、特異性について検討せざるを得ない…のでしょうか。その前に、A教授に相談できれば一番だとは思うのですが…。

以上のように参考にさせていただきます。分かりにくい質問に対し、丁寧なご回答ありがとうございました。