ウエスタンブロットの検出感度について

質問

現在たんぱく質定量でウエスタンブロットをやっているのですが
うまくいかず、意を決して質問することにしました。
検出はECL試薬を用いています。

サンプルはしっかりとバンドが検出されるのに、
ポジティブコントロールがうまく検出されません。
ポジティブコントロールとして100μg/mlになっているものを
10倍希釈（10μg/ml）ではかなり濃いバンドが現れるのですが
100倍希釈（1μg/ml）にするとほとんど見えません。
10倍希釈から100倍希釈になった途端にガクンとバンドの濃さが
薄くなってしまいます。

何度やってもポジティブコントロールだけが薄く、
最低でも1μg/mlぐらいまでしか見えないです。
通常、どのくらいが検出限界なのでしょうか？
文献などで調べたところ、1μg/mlはありえないということはわかっているのですが、
実際に実験などで素人がやってみるとどのくらいなのか知りたいです。

サンプルはラインもキレイでいつもしっかりとバンドが現れることから
ポジティブコントロールの希釈という基本的なところに問題がある
のかとも考えています。
転写ムラや泳動ミスではないと思っています。

たんぱく質の種類にもよると思いますが
通常ポジティブコントロールは水溶性なら水で希釈するものなのでしょうか？
何も考えずPBSで希釈を行っていましたがそれがポジコンの検出感度低下を招いているのでしょうか？

とても基本的な質問でお恥ずかしいのですが
かなり追い詰められた状態でこちらに書き込みさせていただきました。
少ない情報のみで大変申し訳ないのですが
どんな細かいことでもかまいませんのでたくさんの回答をお待ちしています。
どうかよろしくお願いします。

回答No.3

geneticist12

>サンプルはラインもキレイでいつもしっかりとバンドが現れることから

とのことなので、ブロットや検出系の問題ではなさそうですね。
そうなると、やはり吸着があやしいです。サンプルというのは生物から抽出したcrudeなタンパク質だと思いますが、そういうのだと、タンパク質種ごとの含有量はごく微量でも、タンパク質全体の濃度が高いので、あるタンパク質が吸着によって失われる、ということがないのです。

お礼

書き込みが遅れてしまって申し訳ありません。
教えていただいたようにサンプルバッファーで希釈したところ
バンドがしっかりと出ました！！
実は半年ぐらい困っていたので本当に本当に助かりました。
自分では気がつかないところもいただいたアドバイスで改善でき、前に進めました。
少ない情報だけでしたのに、丁寧にわかりやすく教えてくださって本当に助かりました。行き詰っていたのでアドバイスが嬉しかったです。

またいつかお世話になるかもしれませんがその時もどうぞよろしくおねがいします！！
本当に本当にありがとうございました！！！

回答No.2

geneticist12

希釈の手順自体は良いと思いますよ。いくら慣れた人でも、正確な希釈列を作るときは、はかり取る体積をある程度大きく固定にします（この場合10 uLですね）。ただ先にも書いたように、希釈液がPBSだと吸着によってタンパク質が失われる可能性があります。PBSにキャリアタンパク質を十分に入れておくか、SDS-PAGEにしか使わないのであれば、PBSでななくサンプルバッファーで希釈した方がいいということです。

ターゲットタンパク質が7.5 ngもあったらCBBで染めても見えるくらいで、抗体で検出したらバリバリに光るはずです。ゲルをブロットせずに染色したことはありますか。泳動をduplicateして一方をブロット、残りをCBB染色してみるといいかもしれません。染色してみると予想外に、タンパク質が乗っていないというようなことはないでしょうか。

タンパク質量に問題がなければ、他に押さえておく点としては、ブロットがうまくいっていないとか、検出系に問題がある可能性もあります。分子量が大きいタンパク質はトランスファーの効率が悪かったり、小さいタンパク質がメンブレンを通り抜けてしまったりすることがあります。等電点によってはトランスファーバッファーなどの条件を振らないとうまくブロットされないこともあります。ブロット後のゲルを染めて見たらタンパク質が残っていたりしないでしょうか。ブロットしたメンブレンをポンソー等で染色してみて、タンパク質が乗っているのが確認できるでしょうか。

回答No.1

geneticist12

>ポジティブコントロールとして100μg/mlになっているものを
>10倍希釈（10μg/ml）ではかなり濃いバンドが現れるのですが
>100倍希釈（1μg/ml）にするとほとんど見えません

必要な情報は、タンパク質の濃度ではなくて実際に乗せたタンパク質の総量（重量）です。濃度に使った体積をかけたものですね。コントロールは生物組織などから抽出したcrudeなタンパク質ではなく、精製した標的タンパク質単体のことですよね

一般的に、Western blotではpgオーダーの標的タンパク質が検出できる性能があります。これは、CBB染色（検出感度は数ng）で全く見えない量です。1μg/mlの標的タンパク質なら、1/1000 uL程度でも検出できるはず。

>通常ポジティブコントロールは水溶性なら水で希釈するものなのでしょうか？
>何も考えずPBSで希釈を行っていましたがそれがポジコンの検出感度低下を招いているのでしょうか？

希釈の方法に問題がありそうです。考えられるのは器具（チューブやピペット）に対する吸着です。たとえば、チューブ壁が10 pgのタンパク質を吸着する容量をすると、回収可能なタンパク質は、1 ng入れたときは990 pg、100 pg 入れたときは90 pgと、希釈するほどロスの割合が高くなっていきます。その程度なら、検出したときに、それほどのインパクトを感じないかもしれませんが、10 pg入れたら0になって検出不能ということになりますね。

これを防ぐのには、
希釈を1xサンプルバッファーで行う。高濃度のSDSで吸着が防げると期待できます。
または、PBSなどで希釈するなら、BSAなど検出系に干渉しないキャリアタンパク質を過剰量加えたもので行う。これなら標的タンパク質を希釈しても総タンパク量がほとんど一定で、希釈による相の変化（希釈によるタンパク質の不安定化など）を起こさず、また過剰量のキャリアタンパクと競合することで、標的タンパク質の吸着を押さえることが出来ます。

補足

早速のご回答ありがとうございます！！

＞必要な情報は、タンパク質の濃度ではなくて実際に乗せたタンパク質の総量（重量）です。
そうなんですね。いつもウェルに15μl（サンプル7.5μl＋サンプルバッファー7.5μl）添加していますので、実際にのせている量は7.5ng/7.5μlです。それ以下ではまったくバンドが見えません。

コントロールは精製した標的タンパク質単体のことです。

希釈の方法に問題があるとのご指摘ありがとうございます。
初心者であるということも頭に入れてあまり1μlなどあまり少量だとピペットマン使いの不慣れさから誤差が現れるかと思い、
100μl/mlのポジコン10μl＋PBS90μlに希釈しピペッティングした後、ボルテックスで混ぜ、今度はその希釈液から10μl＋PBS90μlというように次々と希釈していました。
こんなに高い濃度の段階で希釈できないなんてと自分の実験の技術のなさを恥ずかしくいます。
今、希釈について書いたことでまだお気づきの改善点などがあれば
ご指摘いただければと思います。

まだpg単位までいっていないのに、ご指摘いただいたところを直すことで大きな違いがあらわれるかわかりませんが、明日、希釈時に使っていたPBSをサンプルバッファーに変えて希釈し、実験してみます。