Western blotting について

質問

ラット大腸粘膜をスクレイプしたサンプルを用いてWestern blottingを行っています。

現在、β-catenin (Cell signaling #9562 Rabbit poly)の検出をトライしているのですが、Positive controlのβ-actin(SIGMA Mouse mono)は発光30秒でしっかりバンドが確認できますが、肝心のβ-cateninは10分発光しても全くバンドが出現しません。

ウェルに注入するサンプルはタンパク量10μgで10μl前後です。

ブロッキングは5%スキムミルクで一晩、
１次抗体は添書通りの1;1000の希釈で室温60分、
β-cateninの２次抗体にはABR社のDonkey Anti Rabbit HRPを用いて、添書では1:2500の希釈を1:1500で室温60分反応させています。

発光にはECLを用いてLAS-1000 plusで撮影しています。

Western blottingの経験がほとんどないため、どこから改善していくべきか教えてください。

メンブレンは冷凍保存しています。

回答No.2

lamb1204 · ベストアンサー

バンドが出ない以上、感度を上げるという方向性と、サンプルの信用度を確かめるという方向性じゃないでしょうか。
サンプルのほうは私にはわからないので、感度を上げる方法ということになりますが…
1さんの選択肢のほかには、、、

・供試タンパク質量を増やす
・ECLをECL plusに変えてみる（advanceはどうかなぁ…）
・X線フィルムで検出してみる（X線フィルムならO/Nで感光させるのもアリ）
・Can Get Signal (TOYOBO)を使ってみる（イムノブロット用は使ってないのでわかりませんが免疫組織染色では明らかに感度が上がりました。）
・抗体濃度（一次・二次）を調節する

チャレンジしやすいものから手当たり次第やるしかないですね。そのとき、非常に大事なのは、ポジコンをきちんと取ること。

お礼

ありがとうございます。
メンブレンを保存していますので、まずは抗体濃度の調節からやってみたいと思います。

…既出の論文からタンパク質量不足が原因かもしれません。

回答No.5

geneticist12

3ですが、アドバイスをつけくわえます。

＞実は当教室ではご指摘のような添え書きでも60分室温で概ね良好な結果が得られているようでしたので、あえてオーバーナイトしませんでした。

市販品を使う場合、供給元が条件検討や実施例の収集をやっていますから、まずは、説明書を読んで忠実にやってみるのが基本中の基本です。
勝手に違う条件でやってうまくいかないと不平をいうのも、だから条件検討を自前でやるというのも愚の骨頂です。自分で作った抗体だと、条件検討にかなりの労力を割かれますが、市販品だとお金を出せばモノが手に入るという以上に、条件検討がスキップできるというのが大きな利点です（それも価格のうちだと考えていいです）。

もし、供給元の指示通りにやってうまくいかないなら、まず技術担当に相談するのが早道です。彼らは、ノウハウをもっているはずですし、説明書以上の情報があるかもしれませんし、また、彼らにとってもトラブルのフィードバックは貴重です。遠慮することはありません。

＞次はやはりオーバーナイトでやろうと思っています。

4℃というのも無視しないほうがいいです。抗原抗体反応も化学反応の一種なので、一般的にある程度温度が高いほうが反応速度があがります（37℃でやるといいかも、というのも主にこのため）。しかし、解離定数の高い抗原抗体反応だと温度が高いと結合より解離の速度が速く抗原抗体複合体の状態を保ちにくいのかもしれません。4℃にするということは、結合状態を保ち解離を抑えるのに必要な条件で、そのかわり、反応速度は遅くなるのでオーバーナイトが必要なのかもしれません。

お礼

ありがとうございます。
まさにおっしゃる通りです。
プロトコール通りにやってみます。

回答No.4

Peptide

一次抗体を思い切り濃くしても出ないようなら、
サンプル中の抗原には反応しにくいとみて、一次抗体を変更。
うっすらとでも出ているなら、改善の余地はありますが、
サンプルを疑うか、一次抗体を疑うか、どっちかでしょうね。

お礼

ありがとうございます。

なるほど、そうですね。
まずは１次抗体の濃度を1:100程度でやって、それからサンプル量を増やしてみます。

回答No.3

geneticist12

＞１次抗体は添書通りの1;1000の希釈で室温60分、

当該製品の添え書きには

＞IMPORTANT: For Western blots, incubate membrane with diluted antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS, 0.1% Tween-20 at 4°C with gentle shaking, overnight.

とああるようですが、、、、、、

参考URL：

http://www.cellsignal.com/pdf/9562.pdf

お礼

ありがとうございます。

実は当教室ではご指摘のような添え書きでも60分室温で概ね良好な結果が得られているようでしたので、あえてオーバーナイトしませんでした。

次はやはりオーバーナイトでやろうと思っています。

回答No.1

shellm

抗体の反応温度を変えてみてはいかがでしょうか。
私は室温から37℃に上げたところ、上手くいったことがあります。

使用している試薬等が違うので、上手くいかないかもしれませんが、
参考までに。

お礼

ご回答ありがとうございます。
今後37℃での反応も検討してみます。