ウェスタンブロットでバンドが出ない

質問

あるサンプルからトータルプロテイン抽出をして、ODチェックをした際にはある程度充分なプロテインが採れていたのですが、ウェスタンをしてみるとまったくバンドが出ません。内部コントロールとして使ったα-tubulinでもバンドが出ませんでした‥。ポジティブコントロールとして使った別のサンプルではしっかりバンドが出るので抗体や試薬、手順には問題は無さそうなのですが‥。ODの値通りにサンプルが採れていないと考えるべきなのでしょうか？
他にも可能性のある問題点があれば、ご意見を頂ければ幸いです。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

泳動後のゲルやメンブレンをポンソーSで染めて
タンパク質がどのくらいのっているかを確認してはいかがでしょうか。

CBBなどでもできると思いますが、
WBに影響が出るかもしれません。

それと、使ったバッファー内の界面活性剤などが濃度測定に影響を与えているかもしれません。
バンドが見えた別のサンプルも一緒に濃度測定してみてはいかがでしょうか。

お礼

回答ありがとうございました。
なるほど、まずはゲルを直接染めて見てみれば早いですね。WBはあまり経験が無いもので素人同然で‥。

界面活性剤が濃度測定に影響を与える事は知りませんでした‥。SDSがサンプルに入っていたのですが、これは充分希釈して測定すれば影響を抑えられると考えてもよろしいでしょうか？

回答No.3

erinyan4912

まず、タンパク質の量が十分かどうかなどを判定するのにO.D.はあまりオススメできません。O.D.を測定する際、抽出に用いたbufferの成分によって大きく影響を受けるからです。よく抽出に用いられる成分の中ではUrea、Thiourea、グアニジン塩酸などの変性剤や、難溶性タンパク質の抽出のためのdetergentなどはO.D.が高くでたり不安定だったりと様々な影響があります。ですから、サンプル自体はevidence74さんが思っている程無いかもしれません。しかし、ウェスタンで行っている以上、感度が良いはずですから全く検出されない原因は他にあるのでは、と思います。検出方法は何を使っているのでしょうか？4-クロロ-1-ナフトールやアルホスでしょうか、それとも化学発光でしょうか。もしかしたら抗体の反応性が落ちているとしたら化学発光でインキュベート時間と露光時間を長くしてみたらでてくるかも。ポジコンとして使った別のサンプルのbufferやPAGEサンプルとしての状態は全く同じですか？トータルタンパク質の方が強い変性を行っているということはないでしょうか？タンパク質の変性・未変性や変性具合によって、抗体が反応したりしなかったりしますので、そこのところを再度確認することが必要と思います。

お礼

回答ありがとうございます。
ODはあまり信用できないんですね‥。濃度測定用の試薬のマニュアルをみたら、影響を受ける試薬がたくさん載ってました。その中のいくつかの試薬も使用していたので濃度が正確ではなかったのかもしれません。
検出方法は化学発光です。インキュベート時間はプロトコール通りで行いました。露光時間はかなり長く（10分くらい）までやってみたのですが、全然見えませんでした。次回は少し長めにインキュベートしてみます。ポジコンも全く同じ方法で抽出したサンプルなので、バッファー含め同じ組成であると思います。

回答No.2

MIYD

私はBioRAD社のProtein Assay 染色液を使っていますが、
使っているlysis bufferだと1/200~1/600くらいに希釈して測定しています。
また、BSAスタンダードも同じbufferの終濃度になるように入れています。

薄めすぎるとタンパク質が薄くなって測定しにくくなるので、
一度BSAの濃度を3段階くらい用意して、
lysis　bufferをどのくらい薄めれば影響があまり出ないのかを見ておいたほうがいいと思います。

お礼

回答ありがとうございました。
試してみたいと思います。