ウエスタンブロット

質問

細胞からタンパクを抽出してウエスタンブロットをやっているのですが、目的のバンド以外もでてしまいます。
条件をかえてやってみても同じでした。
タンパクの抽出方法に問題があるのでしょうか。
現在の抽出方法は、
PBSでwash→RIPA Buffer加えcell回収→シリンジ通す→4℃でインキュベート後遠心し上清使用
です。
回答よろしくお願いします。

回答No.2

geneticist12

＞条件をかえてやってみても同じでした。

どういうことをやりましたか？　抗体の希釈を上げてみるのはやってみましたか。

抗体なんて得てしてそういうもので、交差反応は多かれ少なかれあるので、免疫した抗原と同じものだけに反応するとは限りません。ですから、そういう問題があるときは、自前で作った抗血清にしても市販品でも、アフィニティ精製や前吸収をして交差反応をする抗体成分を除去するということを試みます。
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa1528372.html
http://oshiete1.goo.ne.jp/qa1410356.html

お礼

回答ありがとうございます。
抗体の希釈はやりましたが、もう一度条件を検討したいと思います。
ありがとうございました。

回答No.1

taronbe

抗体が目的の蛋白以外にくっついているのか、あるいは目的の蛋白が分解して分子量が変化したのが混ざったのかだと思いますが。
出たバンドの分子量はどれくらいでした？

目的蛋白まで書いてしまうと実験者を特定される可能性があるので書かなくてもいいですが。

補足

回答ありがとうございます。
50KDa付近と70KDa付近にバンドがでてしまいました。

よろしくお願いします。