酵素処理（ダブルダイジェスト）

質問

いつもお世話になっております。
ダブルダイジェストでの制限酵素処理について教えて下さい。

現在、発現ベクターへのクローニングを、PCRproductを制限酵素処理→ベクターへ導入のプランで行う予定でいます。
その際、同時に行えるようにと、同じバッファーが使用可能な制限酵素を選択しました。

と、ここまではいいのですが、ある人からPCRproductとベクターを１チューブに入れて酵素処理を行う事が出来るという事を聞きました。
これが可能であればすごく手間が省けて言いと思うのですが、本当にその様なことは可能なのでしょうか。
また、実際にそれを行う場合の条件はどの様なるのでしょうか？
（当方では制限酵素はHindIII・KpnIで、Mバッファーを使用しようと思っております。）

もしこの様な方法をご存じの方、もしくは実際に行われたりされている方がいらしたら教えて下さい。
宜しくお願い致します。

回答No.2

otx · ベストアンサー

具体的にどのステップを心配されているのかわかりませんが、

制限酵素処理の場合、制限酵素には最適なバッファー条件がありますので、PCR反応溶液を入れすぎてそのバッファー条件を壊さなければ大丈夫だと思いませんか？

次にライゲーションの場合、PCR産物とベクターが入った制限酵素処理液をそのままエタ沈してそのままライゲーションに持っていくと、
PCR産物とベクターから遊離した切れ端も存在するので。多少目的のライゲーションの邪魔をするかもしれません。

しかし、それが通常と比較してどの程度の効率の違いかは実際してみないとわからないと思いませんか？

一般的な方法かという質問については、より一般的ではないと思います。でも、この方法でやったことない人がどうこう言っても机上の空論なので、実際やっている人にどういう具合か聞いてみるとイイと思うのですが、後は自分の判断でしょう。

お礼

重ねてのご回答ありがとうございました。
当方からのお礼が遅くなり、申し訳ありません。
結果的には問題なく行えました。

＞次にライゲーションの場合、PCR産物とベクターが入った制限酵素処理液をそのままエタ沈してそのままライゲーションに持っていくと、
PCR産物とベクターから遊離した切れ端も存在するので。多少目的のライゲーションの邪魔をするかもしれません。

仰る通り、このステップでの効率の低下が心配でしたが、さほど気になる程度ではありませんでした。
ありがとうございました。

回答No.1

otx

＞これが可能であればすごく手間が省けて言いと思うのですが、本当にその様なことは可能なのでしょうか。

質問者様は、何を心配されているのでしょうか？

制限酵素で切れないと心配なのでしょうか？
その後のライゲーションがうまくいかないかもと心配なのでしょうか？

補足

こんにちは。
質問が解りづらくてすみません。
ベクターとPCRproductの制限酵素処理を行う際の疑問です。
クローニングの際の制限酵素処理で、ベクター・PCRproductのそれぞれを
別々のチューブで酵素処を行ってライゲーション、という流れが一般的だと思っておりました。
しかしこれを、1つのチューブにベクターとPCRproductを入れ、一緒に酵素処理をしてしう、という方法を行っても
その後のライゲーション処理は問題なく行くのかな、と思ったのです。
それともこの方法も一般的なものなのでしょうか。
宜しくお願いいたします。