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有機酸分析 ポストカラムBTB法について
醤油の有機酸をポストカラムBTB法で分析しています。しかし、ピークが出ず、データーが取れません。また出たとしてもピークがとても小さいです。カラムはGL-C610H-Sで、溶離液は３ｍMの過塩素酸をろ過してから使用しています。標品は1mg/1mlになるようにそれぞれの試薬を調整し、濾過してHPLCにかけ、醤油は水で10倍希釈した後、濾過して分析しています。気になるのが反応液の0.1ｍMBTB溶液です。0.1mMBTBと15mMリン酸水素二ナトリウムの混合溶液 のようですが、BTB はMSDSで調べたところ水には難溶との事で、指示薬として使われるBTB溶液はエタノールで溶かしてから水に溶解させると書いてありました。反応液として使うBTB溶液にはエタノールを使用してもよいのでしょうか？もしくは使用しないと溶けずに反応がうまくいかないのでしょうか？また、過塩素酸の濃度を変えれば分離しやすくなるのでしょうか？手順が間違えている、ここを改善したらピークが出るのでは等のアドバイスがとても欲しいです。長文になってしまい、申し訳ございませんでした。どなたかご解答いただけたら幸いです。
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- c80s3xxx
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7.2 ということはもっとも緩衝しているところですから，感度は最低になります． となると，もっと酸を増やすか，逆に減らすか．1.5mM くらいまで下げるか，10mM くらいまで上げてみたほうがいいでしょう．
- c80s3xxx
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もう一つ確認してください． ドレーンから排出される廃液の pH と吸収スペクトルを見てください．廃液でなくても，溶離液と反応液を1:1で混合させたものでもいいです． これが pH 5～6 程度が，たぶん感度的に有利になるところだと思います．あるいは8を少し越えるくらい．そのくらいになってるでしょうか．
お礼
何度もわざわざありがとうございます！pHを測定したところ7.2から7.4の間ぐらいでした。試行錯誤しながらやってみたいと思います。気にかけてくださって本当にありがとうございます。
- c80s3xxx
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リン酸水素二ナトリウムは，バッファーではなく弱塩基ですから，エタノールを加えたりしなくても 0.1mM くらいなら BTB は溶けそうに思いますが． ポストカラム反応液はちゃんと青くなってますか? この方法は，BTB の非解離体に起因する 450 nm 近辺の吸収増加か，BTB の解離体に起因する 600 nm 近辺の吸収の減少で検出するわけですが，そのためには弱酸の存在による pH 変化がなくてはなりません．そしてこの変化は pH 7 近辺 (BTBの pKa 近辺) でしかおこりません． 15mM リン酸水素二ナトリウムに対して3mM の過塩素酸では酸が不足しすぎで有機酸の有無によって色変化が小さいという可能性があります． BTB の変色域等を考慮すると，発色液の Na2HPO4 と溶離液の強酸濃度は，流速を同じにするなら同程度が合理的だと思います． #1 の参照先では 30mM リン酸二水素ナトリウムに対して，0.3% の TFA を設定しています．これはモル濃度にすると 40mmol/L 程度です．個人的にはもう少し薄くしてもいいように思いますが，分離の問題もあるのでしょうね．
お礼
ご回答ありがとうございます。反応液はきれいな青色になるのですが、BTBを超純水に溶かしてからリン酸水素二ナトリウムを加えていたので、今度はリン酸水素二ナトリウムにBTBを溶かして調整してみたいと思います。流速は反応液、溶離液ともに0.5ｍL/minに設定してあります。他の文献では５ｍMの過塩素酸の使用例もあるようなので、BTBを調整しなおしてもピークが出なかった場合、濃度を考えてみようと思います。丁寧なご解答有難うございます！機会がありましたらまたよろしｓくおねがいします。
ＢＴＢは中性の水には難溶で、アルコールに溶かしてから水で基準濃度に合わせます。アルカリにも溶けますが、リン酸緩衝液を使うので、アルコールで溶かして良いと思います。 この方法に関しては日本語のページがありますので、参照して下さい。 ＧＬサイエンス様のページ、↓ http://www.gls.co.jp/technique/technique_data/gl-7400_technical_note/No_1.pdf http://www.gls.co.jp/technique/technique_data/gl-7400_technical_note/No.24.pdf 分析条件が詳しく載っています。
お礼
ご解答有難うございます！メタノールで溶解したBTB溶液も調整してみたいと思います！ページ大変参考になります。色々試してみながら実験してみたいと思います。
お礼
御礼が遅くなり、申し訳ございませんでした。酸を増やして調整したところ、ピークが出るようになりました。何度も回答をいただいてほんとうにありがとうございました。