タンパク質分子への色素の導入法

質問

バイオテクノロジーは素人です。
タンパク質分子に、染色や蛍光による確認のため、色素・蛍光団を組み込む方法としてはどのような手法があるのでしょうか？
あらかじめ色素を組み込んだアミノ酸をポリめらすのでしょうか？
それとも、色素分子に固定化部位をつけておいて、タンパク質分子に固定化させる（光親和性プローブみたく）のでしょうか？

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

どのような条件で観察するのかによって、
確認方法はいろいろあります。

とりあえずは、
細胞の中で局在を見る(２，３，４)。
たんぱく質を抽出して、電気泳動してから見る（１，３，４）。
によって使える方法が変わります。

１．ある程度非特異にたんぱく質に結合する色素を、直接たんぱく質に結合させる方法
（電気泳動などと組み合わせて使います）

２．蛍光を発するアミノ酸の配列と、目的のたんぱく質をつなげて発現させる方法

３．目的のたんぱく質だけに結合する抗体に、色素を作らせるための酵素や蛍光物質を結合させておいて間接的に見るという方法

４．目的のたんぱく質に抗体が結合する配列をつなげて発現させて、その部分を抗体で検出する方法
（目的のたんぱく質用の抗体がない場合に有効です）

などはあります。
固定化という表現がよくわかりませんが、目的のたんぱく質と特異的に結合する抗体がそれに相当するのでしょうか。

色素とあらかじめ結合させたアミノ酸を使う方法は聞いたことがありませんが、
35Sなどの放射性同位体入りアミノ酸を細胞に取り込ませて、たんぱく質に取り込ませて検出するという方法はあります。

お礼

なるほど、よく分かりました。
どの方法も納得いきました。ありがとうございます。

ただ、私が良く分からなかった報告がありました。
東京大学の相田卓三先生のところの例で、シャペロニンの開口部（というのでしょうか？）にアゾベンゼンを結合させて、シャペロニンの穴の開き加減を調節した例があったのですが、あれはどうやって目的位置にアゾベンゼンを固定化したのかなぁ？というのが分かりません。
ご説明いただいた例だと、このように色素分子を狙った位置につけることはできない気がしたのですが。

回答No.2

Dr_Hyper

蛍光ラベルしたアミノ酸を取り込ますというよりは、蛍光物質をアミノ基カップリングで蛍光分子を「べたべた」目的タンパク質に付けるのが普通です。抗体ラベリングキットなるものが売っていますので、それらを応用して使用できます。
きれいな例では、微小管の構成分子チューブリンをこの方法でラベルして生細胞にマイクロインジェクションし細胞の分裂を観察することができるなど、タンパク質の動きを可視化することが可能です。一方このラベリング法はタンパク質によっては他のタンパク質と結合する為に重要なアミノ酸がマスクされたりする可能性があり、タンパク質一般に通用するとも限りません。特異的抗体があり、固定したサンプルでの蛍光を観察するのであれば、No.1のお答えにもありましたように、蛍光抗体法が使えます。遺伝子操作ができるのであれば遺伝子をいじって融合タンパク質を作製し、固定してよいのであればその融合タンパク質に対しての蛍光抗体法、生細胞でみたいのであれば、蛍光タンパク質（GFPなど）や細胞膜を透過する蛍光物質を使用するなどがあげられます（TOYOBO snaptagなどは最新の技術のひとつです）。蛍光試薬の中には細胞中の特定の分子のみに結合し蛍光を発するものもあります。たとえばファロイジンはF-actinに特異的に結合します。
ご参考になれば幸いです。

参考URL：

http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/lifescience/tech/upload/upld84/psg/snap84ps02.pdf

お礼

具体的な例についても解説いただき、ありがとうございます。

有機の色素分子を入れるというよりは、蛍光タンパク質を利用する方がいろいろできるみたいですね。