細胞内の目的蛋白質を蛍光標識したい

質問

こんにちわ。
題名とおり細胞内のある目的の蛋白質を蛍光で標識したいのですが、具体的なプロトコールとしてはどのようにすればよいのでしょうか。

免疫染色などでできるといわれたのですが
どんな抗体を使っていいのかも分かりません。

色々と調べたのですが実用的なことが専門外なものでいまいち分からなくよくわかりません。

わかりやすく教えていただけるとうれしいです。
よろしくお願いします。

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

目的の蛋白質の局在(どこにあるか)を調べるために、
蛍光物質を目的の蛋白質につけたいという意味でいいのでしょうか。

具体的なプロトコールでしたら、
私は接着性の細胞の場合しかやったことがありませんが、
http://www.nuncbrand.com/page/en/229.aspx
のチャンバースライド上で細胞を培養して、

PBSで1回洗う
100%メタノール(15分、-20℃）
｛細胞を固定する｝

PBSで2回洗う
0.1％TritonX100 in PBS(4分、氷上）
｛透過処理（抗体が細胞内に入れるように細胞膜に穴をあける）｝

PBSで1回洗う
3% BSA/PBS (15分、室温）
｛ブロッキング（抗体が目的の蛋白質以外と結合しないようにする）｝

1次抗体
（目的の蛋白質をエピトープとする（目的の蛋白質と結合する）抗体、あれば蛍光標識されているもの）
を 3%BSA/PBS で適切な濃度に希釈したもの
(抗体によって濃度が異なる)(1時間、室温、必要ならば遮光）
｛目的の蛋白質に抗体(場合によっては＋蛍光物質)を結合させる｝

上記の抗体に蛍光標識がついていればPBSで2回洗って観察
付いていなければ、

蛍光標識された2次抗体(1次抗体をエピトープとする) in 3%BSA/PBS（1時間、室温、遮光）
｛1次抗体に蛍光物質がついた2次抗体を結合させる｝

PBSで2回洗って観察

で観察していますが、
細胞や、見たい蛋白質によって、
固定、透過処理、ブロッキングに使う試薬、温度、時間は変わる可能性があります。

英語ですが、抗体のメーカーさんが提供しているプロトコルなので、一度読んでおいたほうがいいかと思います。
http://www.cosmobio.co.jp/technical/tech_SCB_20040219/Res_Appsa.pdf

抗体については、
目的の蛋白質が有名なものであれば、市販されている場合がありますので、
http://www.funakoshi.co.jp/search/search.php?type=0&submit_new_x=true
http://www.scbt.com/
などで一度検索してみてはいかがでしょうか。

抗体が市販されていない場合は貰うか、自分で作るか、業者に発注することになるかもしれません。

免疫染色以外の方法としては、
目的の蛋白質をコードする塩基配列を入手して、
GFPなどの蛍光蛋白質との融合蛋白質遺伝子を作り、
これを発現ベクターに入れて細胞にトランスフェクションし、
蛍光の局在を観察するという方法もあります。
でも、融合蛋白質にすることによって局在が変わる可能性があるため、
このデータだけを元に局在を示すのは問題がある場合があります。

お礼

分かりました。
ご丁寧にありがとうございます！