細胞における疎水性タンパク質の蛍光抗体反応

質問

現在，蛍光色素で標識したモノクロナール抗体を用いて，タンパク質顆粒の細胞内局在を観察したいのですが，そのタンパク質顆粒の性質が疎水性が非常に強いためか，うまく蛍光観察像が得られません．また，非特異的と思われるものが多くみられ困っています．　なにか対策などご教授いただきたいです．

回答No.2

otx

質問者様の行われたウエスタンブロットは、おそらくSDSを使ったもので、Native-PAGEではなかったのではないでしょうか？

SDSを使ったウエスタンブロットのサンプルは操作上からわかるとおり、タンパク質が変性しています。

その抗体は少なくとも変性状態のタンパク質を認識する抗体（ウエスタンで使える抗体）であることが明らかになっているだけであって、それが必ずしも免疫染色で使える抗体であるとは言えませんし、実際、いろんなメーカーの一次抗体を見ていただくとわかると思いますが、ウエスタンに使えるけど免疫染色には使えないとか、免疫染色でも免疫蛍光染色にはつかえるけど免疫組織化学的手法には使えないとか、いろいろあるのです。

免疫染色では、組織の固定法によってタンパク質の構造が変ってると思われます。ホルマリンではpHを中性域で固定するとタンパク質はNativeなフォームである可能性が高いです。また凍結でもそうです。
酢酸などをベースにすると変性していると思われます。

自分たちで作った抗体の場合、どのような実験に使えるのか、まず自分たちで確認する必要があります。

それをまずやらなければならないと思います。免疫染色で使えない抗体をどんなにいじっても、染色像は得られないからです。

その確認方法は考えられてください。

ちなみに私は、ウエスタンで使えるかということで変性状態は認識するのかという情報にします。免疫沈降ができるかどうかで、Nativeなタンパク質を認識するかどうかという情報にします。
あと、免疫染色は通常の条件でやってみて、その結果をみて、経験上、シグナルが出そうかそうでないかを考えて改良するかしないかを考えます。

これは自分で抗体を作った時の常識であると思いますが。

回答No.1

otx

その一次抗体の使用方法などをデータシート等で確認しましょう。

それには何か書かれていないでしょうか？
まずはそれからだと思います。

お礼

抗体は研究室で独自で作製したものらしくてウエスタンなどではきれいにバンドがでるのは確認できています。
なぜか蛍光観察では思うような結果がでません。