ロイシン ウリジンの取り込みについて

質問

細胞に薬剤を入れて、タンパクとRNA合成が
どのように変化するかという実験をしています。

　今まで私が所属しているところでは
RIのみ（0.67μM）を加えて一時間インキュベートを
していましたが、これだと取り込み量が少ない
ので、コールドのロイシン、ウリジンを加えようと
いうことになりました。

　とりあえず１０μMを加えて実験をしなさいと
の支持で実験をしてみたのですが、
適正の濃度ではありませんでした。

　もし同様の実験をされている方がいらしたら
加えるコールド（RIでない）のロイシンと
ウリジン濃度を教えていただきたいのですが。
　よろしくお願いします。

回答No.3

Sbacteria · ベストアンサー

>反応をとめて細胞を集め、洗い、細胞のペレットをいきなり５％TCA処理して（界面活性剤はなにも加えません）、それを遠心もせずにGF/F　フィルターにトラップさせてそれをカウントしています。

この方法だと、高分子に取り込まれたものだけでなく、膜胞（一番大きいものが細胞膜）に取り込まれたものすべてがトラップされます。フィルターを洗う時の洗浄液を工夫すれば、それでも良いかもしれませんが．．．．この実験だと、取り込み活性の測定を観ているだけのような気がします。面倒でも、細胞破砕のステップを入れる事をすすめます。
例えば、1mM Leu、5% SDSを含むPBSで懸濁して、一定時間インキュベートし、それからTCA沈殿させ（フィルターだけでも良いです）、そのフィルターを1mM Leuを含むPBSで十分洗って、フィルターのカウントを測定してごらんなさい。コールドのロイシンで洗うのは、吸着しているモノマーを交換するためです。タンパク質に取り込まれたLeuは入れ替わりませんから、高分子に取り込まれたホットの量（これが調べたいタンパク質合成量）はそのままで、バックを減らす事ができます。
　今測定している、カウントから計算して、通常のタンパク質合成量に合いますか？おそらく、その何十倍かあるのでは？

お礼

どうもありがとうございます。

今　上の人たちが不在なので来週実験に
ついて話をしたいと思っています。

　もっとおうかがいしたいことが出てくる
と思うので、まだ締め切らずにいさせて
もらいます。

　またお願いします。

回答No.2

Sbacteria

＞培地はES mediunm 2%FBSです。
と言うことは、培地中に既に十分量のLeuは含まれているということですね。それなら、少量のホットのLeuを加えても十分なはずです。

次は、どういう操作をして、何の放射活性を計っていて、それがどうなっているのか？（文章を読んだだけでは、何が悪いのか全く理解できません）説明してください。

ある薬剤を加えた実験系　Iと加えない（あるいは薬剤だけ抜いたものを加える）実験系　IIを比較するとします。　まず、最初に薬剤が細胞の生育に影響があるか調べ、濃度依存性を調べておきます（ここまではやってあるのですね？）。薬剤の効果の何をみたいのかがさっぱり分からないので、想像するしか無いですが、生育阻害が観察できるぎりぎりの濃度で、実験して、実験系I, IIの両方にホットのLeuを加えます。　次に、一定時間後、コールドのLeuを大量に添加して、細胞をプレートから剥離して、遠心で集めます。ここからは、（１）界面活性剤を十分に含んだ溶液に溶かして、SDS-PAGEにかけ、高分子への取り込みをオートラジオグラフィーで観察する　　か、　（２）界面活性剤で抽出した溶液（軽い遠心でデブリスは捨てる）を酸変性させて、高分子をフィルターでトラップして、トラップされた放射活性をシンチレーターで測定する。　の２つがあり得ますが、（１）の方が実験としては面白いと思います。

　想像で手順を書きましたが、実際はどうしているのでしょうか？

補足

たびたびありがとうございます。

　使用している薬剤はｍRNAのハイプシン化の
阻害をしるのではないかと考えられています。
薬剤の濃度等は以前の学生が実験をして
論文を出しています。
　ｍRNAの量の違いをみるまえに、total RNAと
タンパク合成量の違いをみようということに
なっています。

　薬剤を入れて一時間カルチャー後に、コールドの
ウリジン、ロイシンそれぞれで、反応をとめて
細胞を集め、洗い、細胞のペレットをいきなり
５％TCA処理して（界面活性剤はなにも
加えません）、それを遠心もせずに
GF/F　フィルターにトラップさせてそれを
カウントしています。

　デブリスっていうのは細胞片ということでしょうか？　それごとトラップしています。

　これまでもこの研究室ではこういう
方法で実験をしていましたが、どうなんでしょう？
　改善すべき点等教えていただけますでしょうか。

　よろしくお願いいたします。

回答No.1

Sbacteria

培養している細胞は何か？その遺伝子型は？
使用している培地の組成は？
これらが記述されていないと一般論で話をするしかありません。
　通常は、ロイシンはNa+とのシンポートで細胞内に輸送されるので、使用している生物のLeu/Na synporter のLeuに対するKmが分かっていれば、その3-5培程度入っていれば十分だと思います。
　適正かどうかは、どうやって判断していますか？

補足

Km値は以前はかったことがあるとかないとか
で、わかりません。

　細胞は　mouse mammary carcinoma FM3A cellを
つかっています。培地はES mediunm 2%FBSです。

　１０μMでしなさいと指示をされ、間違えて
一回目は１００μM加えてしまいまして、次に
１０μMで実験をしたところ、ロイシンに関しては
RIのシンチレーションのカウントがほとんど
変わらないので、１００μM以上入れなさいと
次回の実験の指示がでました。
（以前コールドのロイシンを加えなかったときに
比べるとカウントは3分の１下がっています）

　ウリジンに関しては、１０、１００両者とも
コールドを加えないときの実験のときと
カウントが変わらないので、これももっと
増やしてするように言われています。