ChIPアッセイ（クロマチン免疫沈降法）がうまくできません。

質問

マウスの脾臓細胞を使ったChIPアッセイ（クロマチン免疫沈降法）に挑戦しています。
しかし、最初のゲノムの断片化がうまくできません。超音波破砕装置はプローブ型、密閉式バス型、いずれも使っていますが、5-10kb程度の長い断片が残ってしまいます。
固定しない細胞では、うまく切断できることから、固定のステップに問題があると考えていますが、室温５分くらいの弱い固定条件でも切断がうまくできません。固定などのプロトコールはUpsutateやコスモバイオによって提供されている、一般的な固定法（終濃度1%のフォルムアルデヒド）です。
SDS　Lysisバッファーにて溶解する時に、未固定の細胞だと粘性がでるけど、固定した細胞だと粘性が出ないなど、固定～Lysisのところに問題があるように思っています。

どなたか、このような問題から、解決された方いらっしゃるでしょうか？

回答No.2

methyl

>回数をもう少し増やしてみようと思います
私もそれがいいように思います。
また、sonicationのpulseはサンプルが泡立たないぎりぎりまで上げるのもありです。
あるいは、サンプル数がいくつかありソニケーターにcycle pulseの機能が有るなら、Cycle pulseを使うとずいぶん楽になると思いますよ。
サンプルを氷水上にフロートに浮かべた状態で
Duty clcle40～50%くらいの条件ならサンプルの温度上昇も問題ないと思います。

私もChIPを以前やっていた頃、マニュアルでよく見かける実質sonication時間が１～２分程度で試してみるとosiete-osieruさんと同様にゲノムの断片化が十分ではありませんでした。検討の結果sonicaterの違いや、おそらくは細胞種の違いでもないようでしたが、結局はsonication時間を上げることでクリアしました。（これは細胞種によって異なると思いますが、osiete-osieruさんの細胞は差し支えが無ければ教えてください。）

いずれにせよ、断片化の条件検討が完璧だと思えるまでは先のステップを行わないことをお薦めします。
ChIPは抗体をはじめとしてコストもかかりますし、
不十分な断片化で出したデータは後々混乱の元になり、ミスリードの原因にもなりますしね。

回答No.1

methyl

>未固定の細胞だと粘性がでるけど、固定した細胞だと粘性が出ない
これは、正常です。
通常固定した細胞にLysisを加えても粘性はでません。
逆に粘性が出たときは固定が甘かったときです。

5-10kb程度の長い断片がでるとのことですが、
どの過程でDNA断片のチェックをしてますか？
破砕後脱クロスリンクする前でしたら、
一度脱クロスリンクしてから再度サイズ確認してください。
脱クロ後でしたら、むしろ破砕の条件を見直す必要が有ります。

補足

ありがとうございます。
クロスリンクは塩を足して、65℃4時間で外してからえいどうしています。
やはり、破砕の条件ですね。
未固定の細胞だときれいに切れるので、ソニケーター自体には問題がないと考えています。
回数をもう少し増やしてみようと思います（既に30秒×10回以上やってますが）。