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分光光度計の使い方について

初めてokwaveを利用させていただきます。宜しくお願い致します。 私は大学3年生で、今年の夏休み明けから生物系の研究室に配属になり、実験の基礎を学んでいます。 そこで、現在は大腸菌を大量培養する際にOD600値の測定をする為に分光光度計を使っているのですが、分光光度計の使い方に不安があり、質問させていただきました。 私が学んだのは、「培養液のみの入ったキュベット(ブランク)をリファレンス側とサンプル側にセットし、オートゼロ(ゼロ補正)を行った後、サンプル側のキュベットを大腸菌入り培養液のキュベットに変え、OD値を測定する」という方法でした。 しかし、いざやってみると、培養時間に対してOD値の上がり方が不安定でした。 具体的に申しますと、培養時間に対してOD値が指数関数的に上昇せず、挙げ句の果てには時にOD値が下がってしまうこともありました。 なんかおかしいなと思い、先のオートゼロの際に使った「培養液のみ入ったキュベット」を再びセットしてみると、OD値がゼロにならず、±0.1ほどずれてしまいます。 もっとおかしなことに、同じ大腸菌入り培養液を複数回測定するとOD値が0.2ほど異なる値が出てしまい、要するに全く再現性が取れていません。 インターネットで調べてみると、オートゼロの際にはリファレンス側にもサンプル側にも蒸留水を入れるなどといった記述もあり、混乱しております。 また、私が習った方法では、キュベットを3本使用するのですが、そもそもそれもおかしな話だなと感じています。サンプル側にセットするキュベットを変えてしまっては、セル自体の誤差が出てしまいます。 そこでお訊きしたいのが、そもそも私の分光光度計の使い方が全く検討はずれなのでしょうか。 ご教授いただけると嬉しいです。

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いくつか一般的な簡単なコメント・確認事項を書かせていただきます。 ・装置が安定してからバックグラウンド・ゼロ点補正・測定を行っていますか? 光源(タングステンか重水素ランプと思います)は電源を入れてから所定の時間がたたないと、出力が安定しません。取扱説明書にこれくらい待ってから使ってね、という指示があると思いますが、たいていのUV/vis分光計では30分~1時間くらいは安定待ちをした方がよいです。 ・バックグラウンド(説明書によっては違う書き方がされているかも)は定期的に測定しなおしていますか?オートゼロ測定で自動的にこれも更新されているのかもしれませんが、もしもそうでないのなら、バックグラウンドも定期的に更新したほうがよいです。要するに、光源の波長ごとの出力パターン・および検出器の校正値を取り込んでおくということです。 ・バックグラウンド・オートゼロのとり方については、培養液でも蒸留水でも構わないのです。短時間で値がずれるというのは、上でコメントした光源・あるいは検出器側の不安定か、バックグラウンドの不備があるように思います。

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