アミノ酸配列

質問

目的タンパクを可溶化するために、全長では可溶化しにくいため、N末端のアミノ酸○○番目で切断して短くして可溶化を試みる。と先生から聞いたのですが、○○番目で切る理由は何でしょうか。。
例えば1～300、301～600、などと切断してはダメなのでしょうか？

あと、遺伝子の構造からタンパク質の機能がわかると聞いたのですが、どうやってわかるのでしょうか？

回答No.3

otx

まず、質問者さんに申し上げたいことは、
もうちょっと「きちんと」勉強した方が良いということです。
ここで、付け焼き刃の知識をもって今後にのぞむのは危険です。

ここでは大まかなことしか答えられません。
わからないのなら、ちゃんと近くにいる先輩、先生に質問しましょう。

で、大まかなことですが、

タンパク質を構成するアミノ酸には、その側鎖の性質から、
親水性、疎水性という性質があります。
それだけでなく、アミノ酸の種類によっていろいろな性質が予想されます。

その目的タンパク質を構成するアミノ酸から、～番以上のアミノ酸配列は
不可溶なタンパク質になるかもしれないと先生は判断したのかもしれません。

実際に、その先生に聞けば理由を言ってくれるはずですので、聞くのが一番早いです。

＞あと、遺伝子の構造からタンパク質の機能がわかると聞いたのですが、どうやってわかるのでしょうか？

それも、実際に聞いて方法を見せてもらいながら教われば、一発です。
実験は特に、実際に近くにいる人に聞くことが最も重要で、且つ確かな情報です。

お礼

ありがとうございます。先生に聞いてみます。

回答No.2

larme001

○○番目というのがいまいちよく分からないのですが、、、。

一般的には、全長でGSTとか可溶性の大きいタグを付けて種々の誘導条件を振っても難しいようだったらドメイン単位とかで作製するのがいいのではないかと思います。そういう意味では1-300番目を削るとか一義的な欠損ではなくてタンパク質のドメイン単位での構造をイメージしながら欠損するのが一般的かと思います。その意味でしょうか？

そもそも可溶化しないのはなぜか？というと、大抵は、本来大腸菌に「あり得ない」、タンパク質を「短時間で」、「あり得ないぐらいの量」に発現させようとするからです。それも、宿主（大腸菌）にとって「致死的」なものであればもっと悪質です。あとは、「疎水性」とか「構造的に（大腸菌にとって）難しい」とかそういうのが組み合わさって結果的に封入体に取り込まれやすいと可溶化しないわけです。要するに、宿主にとって「本来あるべきでない邪魔者」が宿主を死に至らしめる可能性があるため、それを封入体という膜構造に閉じ込めてしまうことによって悪さするのをできるだけ防ごうというものです。もちろん真核生物でも起こりうるのですが、一般的にはその発現量が全体タンパク質で少ないのと、発現が大腸菌ほど急激でないのであまり問題になりにくいというだけで、実際過剰発現で一気に発現させればおこっている可能性もあるわけです。ただ気付かないだけで。

逆にいえば、できるだけ可溶化しやすいようにするというのは、そういうストレスがかかりにくいような条件で誘導がかかることが理想だということです。つまり小さければそれだけ楽だし、そもそも構造的に大腸菌が苦手な部分があればそこを除いてやれば可溶化しやすくなる可能性があり、また温度を下げたり、IPTGの量を調節したりpColdとかを使うのもそういう温和な条件でできる限り最大の発現量を目指すというのが基本だと思います。ただ、遅いとそれだけ発現量が減りますし、栄養も別の要素に使われる部分が多くなる。結局、その辺の兼ね合いがあるのだと思います。

そういう意味で考えれば、当然全く無意味な部分で削ったものは構造的にも不安定になりやすいため、結果的に封入体に入りやすい可能性があります。ただ、多くのタンパク質は複数のサブユニットからなる共通のドメインを持っているため、そういうドメイン単位で欠損したりすることはその部分のみでの制御を議論する上ではあまり問題にならない場合が多いです。だから、そういうドメイン単位での欠損体を作るのが一般的かと思います。遺伝子の構造から機能が分かる（というか推定できる）というのもそういうホモロジー検索などによるものです。（i.e. たとえばDNA結合領域があれば転写因子の可能性が高いとかか、そういう類似性といういみでも。）

ちなみにGST付きで精製してきてもGSTを切り離したとたんに析出するとかもあるので、そもそも性質が不安定なタンパク質の場合は高濃度にするのが難しかったりもしますが、、、。

ｍっとも、結晶化したりする目的の時は、末端の飛び出た部分を削ったりするのでそういうのが可溶化と一義的に関連があるのかは正直分かりませんが、一般的には可溶化が目的ではないきがしますが、、、。

お礼

とてもわかりやすい説明をありがとうございます。

現在抗体を作製するためにGSTをつけた全長の目的蛋白を発現させているのですが、可溶化されないのです。
そこで先生から全長の配列の一部とGSTの融合蛋白質を作製しようと言われたのですが、何故その場所で切るのかわからなかったのです。

共通のドメインがあることを調べるには、どのように調べたら良いのでしょうか？

回答No.1

patent123

たんぱく質を例えば1～300、301～600、などと切断したくても、
想い通りの場所で、選択的に切断できるとは限らないからです。

お礼

ありがとうございます。
○番目で切る、ということは、○番目の配列が切れやすいとか機能がわかっている配列があるということでしょうか？