RNAi について

質問

遺伝子配列も完全に既知のタンパク質(全長で570アミノ酸残基程度)についてですが、
36番目から56番目までの合計21アミノ酸残基部分だけをRNAi などの方法を用いてノックアウトすることは可能でしょうか？
私はずっとタンパク屋としてやってきましたが、これから少し遺伝子をいじることもしなければならなくなりました。
21アミノ酸残基、という短いフラグメントをつぶす良い方法がありましたら、ご教授お願い致します。

回答No.3

Dr_Hyper

どのように、その21アミノ酸の重要性を見いだされたのですか？
内在のタンパク質が残っている状態で、がん細胞にその部分を欠失したものを導入してdominat negativeになるのであれば、欠失変異体で方は付くと思いますが、内在のタンパク質が残っている以上はうまくいかないというのであれば、やはりRNAiに頼るのも一つの手だと思います。
うまくいくかどうかは賭けですが、欠失させたいアミノ酸の領域のオーバーラップする形で機能するsiRNAが合成できれば、内在のタンパク質はこのsiRNAでタンパク量を減少させることができます。そしてそこに、その領域を欠失した変異体を過剰発現させることで、細胞内の機能構成成分を野生型から欠失変異体に入れ替えてしまうというやり方です。ノックアウトマウスをお持ちであれば、単にそのマウスから取り出した細胞に、欠失変異体を導入するだけでもいいですが。余計なことを書きすぎました。失礼します。

お礼

詳しくご解説いただきありがとうございます。
21アミノ酸のフラグメントについて、重要性はまだ未知です。
それを知りたいと思っているところです。
ただ諸実験により(詳しくは申し上げられなくてすみません)
その21残基のフラグメントに注目しています。
今までの研究過程では、動物は一切用いておらず、全て検体または血清等で行っていましたが、
このタンパク質のフラグメントをターゲットにしてやっていく以上、
検体をやみくもに使用することはできないので、培養細胞に移行しようかと考えています。
ありがとうございました。

回答No.2

ga111

21アミノ酸残基じゃなくて、21塩基ですよね？ RNAi(siRNA)ですと。
RNAiはすでに指摘があるように、蛋白全体ができなくなる手法ですよ。
＞21アミノ酸残基、という短いフラグメントをつぶす良い方法
遺伝子工学的に、遺伝子上でその部分を除去します。PCRとかsite specific mutagenesis (メーカーとしてはQuikChangeなどがおすすめ）とかを使います。

お礼

学生時代はまだRNAiなどの技術は存在せず、現在いるところでは「RNAiでつぶせば？」と言った言葉が普通に飛び交っているので、混乱していましたが、おっしゃる通り遺伝子上でその部分を潰すのは学生時代やった記憶が…
あまりにタンパクに専念しすぎていて、分生の今の技術に関する知識はゼロに等しいのでちょっと勉強しないとダメみたいです…
ありがとうございました。

補足

21アミノ酸(ペプチド)に対応するRNAと言う意味です。

回答No.1

blackdragon

RNAiによるノックアウトは、使用したRNAの部分のみではなく、当該遺伝子のRNAが分解されますので、ある部分のみが削れたタンパク質ができるということにはなりません。（そもそも、一部分のみを削るような操作はノックアウトとは呼びません。）

＞21アミノ酸残基、という短いフラグメントをつぶす良い方法がありましたら、ご教授お願い致します。

これが、21残基部分を切り詰めたような状態に改変するという意味だとして、そのような改変タンパク質が得られればいいのか、それとも、ある生物の本来の遺伝子がそのような改変遺伝子に置き換わらなければならないのか、その生物がどのような生物か、などによって、全く違ってきます。

お礼

ありがとうございました。

補足

言葉は間違えているかもしれませんが、
その実験をしたい心は、その21残基を削ることで
本来のタンパク質の機能が失われるかどうかが知りたいのです。
ノックアウトしたのと同じ状態になるのか、何も変化が起こらないのかを知りたいというのが意図です。
質問の仕方を間違えたようですね。申し訳ありません。
ちなみに使用するのは癌の培養細胞です。とにかく正常なタンパク質ではなく、
21残基がないタンパク質が作られれば良いだけです。