実験 誤差 ELISA法

質問

生化学実験でELISA法でウシの血清アルブミンの量を測定しました。
その時結果が含有量より大きな値が出てしまいました。

なぜ、含まれているより大きな値が出てしまうのでしょうか？
また、同時に値を見比べるために、反応しないウシのグロブリンも用いて実験を行いました。
その実験でも、0以上の値が結果として出てきました。

なぜでしょうか？
試薬のコンタミ以外にどんな理由が考えられるのでしょうか、意見を聞かせてください。

回答No.1

noname#160718 · ベストアンサー

ブランクウェルを設定していますか？設定しているなら、そのブランクウェルまで高いO.D.値ですか？
　高いO.D.値といっても、ELISA系の仕様によって一概には言えませんが、O.D.値で0.1以下なら正常と考えて良いと思います。
　ブランクウェルも含め、「陰性検体」が全て陽性のような高いO.D値が出てしまうのでしたら試薬のコンタミの可能性も考慮しなくてはなりませんが、そうでなければ「試薬のコンタミ」は除外して良いと思います。

　ELISAはモノによっては操作の技術についてかなりシビアです。
　最初にプレートに検体をチャージしていく手際が悪いと、最初の検体と最後の検体の時間差が結果に影響します。通常「時間」は最後の検体をチャージしてから計り始めるでしょうから、手際が悪いと最初と最後の検体で数分の時間差が生じてしまい、それが結果をぶれさせる原因になり得ます。
　それは標識抗体をチャージする手際、発色液を入れる手際、停止液を入れる手際全てで関与するので、手際が悪いとトータルでけっこうな差が出てしまいます。

　また、洗いの際も技術が未熟だと検体や標識体が残ってしまい、陰性検体やブランクウェルが発色してしまう原因になります。
　手洗いの場合は液を捨てるときにウェルの間でコンタミが起きてしまうこともあります。

　標識体や発色液を希釈する希釈する際にも、きちんと指定の倍率に希釈できておらず、結果がぶれることがあります。

　つまり、あらゆる操作を高精度でてせきなければ結果はぶれる、ということです。
　ポジティブコントロールが付属していてS/P値等を計算して結果を出す「○×抗体検査キット」のような定性検査のための製品はかなりダルに作られていて、けっこうラフな操作をしてもあまり結果がぶれなかったりするものが多いですが、標準品を用いて検量線を引いて値を求めるような定量検査のための製品は、概ねかなりシビアと覚悟しておいた方が良いです。

　自分の技術が問題ないのであれば、そのELISAの試薬類のぶれが考えられます。つまり、プレートの固相化抗原（または抗体）の量が設計より多いとか、標識抗体の濃度が高い、とかです。
　その場合は、そのロットは全て同じように結果がぶれるので比較的容易に判断できます。

　自分の結果が同じロットを使った他の人の結果と異なるのなら、まず疑うべきは自分の技術ですね。

　自分の技術をチェックする方法はいくつかあるのですが、ご質問が標準品の結果が高く出る、ということなのでしたら、ロットに問題がなければその時点で自分の技術を疑うべきでしょう。むろん標準品がぶれている、という可能性もありますが、それも比較的容易に判別できます。他の人が同じ標準品のロットを用いて異なるELISAのロットを使って出したデータと比較すれば良いだけです。

お礼

丁寧に回答ありがとうございます。
回答を参考し今回の実験の結果を見直すと、
ブランクは0.1以下であったので、実験操作が誤差の原因だと思います。