ELISA法に関する質問

質問

ふたつ質問があるので、どちらか回答できるほうだけでもいいのでよろしくお願いします。学生実験でやりました。
１】乳タンパク質をサンプルとして、抗体の生産性に及ぼす影響をELISA法を用いて検討したのですが、結局途中で測定した細胞数に比例したので、培養したあとの細胞数で抗体生産生を判断できないのでしょうか。つまり、細胞数と抗体の量は比例すると思われるのですが、違うのでしょうか？しかし、比例すると考えるとやはりELISA法を用いる理由がわからなくなります。どうかこの疑問に答えてください。
２】ELISAの操作の初めに固相抗体を結合して、ブロッキングした後、4℃保存しますが、これは何故ですか。説明が足りずにわかりにくければそういってください。

回答No.7

noname#2861

>抗原とは何なのでしょうか。

ややこしいかもしれませんが、この場合の抗原とは、測定されている抗体
（ハイプリドーマが産生する）が抗原となっているはずです。つまり、
ハイプリドーマが産生する抗体を測定するため、この抗体を抗原として免疫して、
得た抗体（ハイプリドーマが産生する抗体に対する抗体）を、測定に用いるのです。

回答No.6

noname#2861

No.５に対する回答です。
＞ということは細胞の数と抗体の量が比例しないということもありえるということですね。

それは、あくまでも結果がそうなっていれば、云えることです。
もし、そういう結果であれば、細胞（ハイブリドーマ）の抗体産生能力が
細胞の増殖によって、落ちている、あがっていることが考えられます。
このことに対する原因は、申し訳ありませんが、回答できる立場にありません。
また、ハイブリドーマはよく、ミューテイションを起こすようです。

ブランクが低くなる件ですが、具体的な理由はわかりませんが（15年ほど前、よく
モノクロを扱ってましたが、忘れました）、4℃くらいの温度で抗体の固相化（固定化）を
するとき、抗体が固相に固定されていないところには、標識酵素抗体が固相に吸着する量が
抗原と反応する量より、相対的に少なくなるため、だったと思います。

お礼

ありがとうございます。
ただ、抗原とは何なのでしょうか。
酵素基質のことでしょうか。
ほかに入れたものはないので・・・

回答No.5

rei00

御質問の意味がよく判らないのですが，いくつか補足下さい。

> 抗体の生産性に及ぼす影響
　抗体はどうやって生産させているのでしょう。
　抗体産生細胞に乳タンパクを投与してですか？

> 結局途中で測定した細胞数
　細胞数はどの段階で測定したのでしょう。
　抗体の量を ELISA 法で測定する時？
　乳タンパクを投与する時？

> 培養したあとの細胞数で抗体生産生を判断
> できないのでしょうか。
　できるかもしれませんが，誤差が大きくなる可能性は否定できないでしょう。

　いま，測定したいのは何でしょうか？「生産される抗体の量」であって「細胞の数」ではないはずです。でしたら，「細胞数」を測って間接的に「抗体量」を求めるよりも，ELISA 法で「抗体量」を直接求める方が適切じゃないでしょうか？

> 細胞数と抗体の量は比例すると思われるのですが、
> 違うのでしょうか？
　これはどの段階でどの様にして細胞数を求めているかに掛かってくると思います。冒頭の補足要求にお答えいただければ，具体的回答も得られるかもしれません。

補足

＞抗体はどうやって生産させているのでしょう。
　抗体産生細胞に乳タンパクを投与してですか？
培地はERDFに血清を加え、これにいろいろな乳タンパクを投与して生産性の違いを見ています。

＞細胞数はどの段階で測定したのでしょう
ELISA法で測定する直前です。その後、上清のみをELISA法で
測定しました。

どうでしょう。ちゃんと補足になっているでしょうか。

回答No.4

noname#2861

ELISAで抗体を測定すると言うことですが、
抗体というのは乳タンパク質の抗体ですか？
また、サンドイッチ法でしょうか？

補足

ヒト型ハイブリドーマの抗体です。
サンドイッチ法とはよく分からないのですが・・・
すいません

回答No.3

noname#2861

今一、よくわかりません。ELISAで何を測定しているのでしょうか。
乳性タンパク質ですかそれとも、抗体を測定しているのですか。
いずれにしても、
比例するかどうかは、実験結果の再現性が得られて判断するものです。
われわれが回答できるものではありません。
あくまでも結果から得られるものです。
先に判っているわけではありません。
想像できることではありますが、それを検証するのがサイエンスです。

ブロッキングはNo.１の方の回答されている通りだと思います。
非特異的吸着を抑えることにより、測定ブランク値も下がります。
4℃保存もブランク値の低下につながるそうです。
また、この手の実験系の溶媒、培地は細菌が繁殖しやすいので、
それも抑えることができるようです。

補足

ありがとうございます。
抗体を測定してます。
実験結果から判断するとありますが、
ということは細胞の数と抗体の量が比例しないということもありえるということですね。
それは何故なのでしょうか。
もしお分かりでしたら教えてください。
また、4℃保存が何故ブランク値の低下につながるのか
わかりません。
そもそも、初めの段階では抗体は入っていないのです。なぜブランク値に影響するのでしょうか。
さらに、培地や細菌の繁殖を抑えられるとありますが、いったん抗体が入ってしまうと37℃で保存するのは、抗体の活性と関係するのでしょうか。

回答No.1

ADEMU

ＥＬＩＳＡ法を用いる理由ですが別にイムノアッセイであれば何でもよいのではないでしょうか。検知できるものがあればＲＩＡ法でもＣＬＩＡ法でも構わないと思います。
ただし、抗体と抗原が１対１で対応していないと難しいのではないでしょうか。
２）の質問は「何故」が何にかかっているのでしょうか？
ブロッキングすることでしょうか、４℃で保存することでしょうか？
ブロッキングでしたら、ブロッキング試薬を使用しないとマイクロプレートに目的物質が非特異的に結合しているために抗体と結合しているのか、プレートに直接結合しているのか区別がつかなくなるからです。

回答No.2

ADEMU

ＥＬＩＳＡ法を用いる理由ですが別にイムノアッセイであれば何でもよいのではないでしょうか。検知できるものがあればＲＩＡ法でもＣＬＩＡ法でも構わないと思います。
ただし、抗体と抗原が１対１で対応していないと難しいのではないでしょうか。
２）の質問は「何故」が何にかかっているのでしょうか？
ブロッキングすることでしょうか、４℃で保存することでしょうか？
ブロッキングでしたら、ブロッキング試薬を使用しないとマイクロプレートに目的物質が非特異的に結合しているために抗体と結合しているのか、プレートに直接結合しているのか区別がつかなくなるからです。

補足

大変わかりくくて迷惑をかけてしまいました。
2)の方は何故「４℃」なのかがわからなかったのです。
もし、お分かりでしたら回答のほうよろしくお願いします。