- 締切済み
alternative splicing? artifact?
あるもののcDNAをRT-PCRで作りました。 得られたクローンの多くはデータベースにある配列と同じでしたが、中にひとつ、42塩基短いものがありました。問題のクローンで欠失している部分と、その前後の配列は、ゲノム上でも連続しており、スプライシングのコンセンサス配列は存在していませんでした。 これはよくある現象なのでしょうか。またその原因は次のどれと考えられるでしょうか。 1) コンセンサス配列が全くないところでスプライスされることがたまにある。 2) RT時に逆転写酵素が高次構造をとっている部分を読み飛ばした。 3) PCR時に読み飛ばしが起こった。
- みんなの回答 (1)
- 専門家の回答
みんなの回答
- kulosu
- ベストアンサー率0% (0/2)
関連するQ&A
- DNAライブラリからの遺伝子クローニング法
『ゲノム情報が未解読の微生物からアミノアシルtRNA合成酵素をコードする遺伝子Aの部分塩基配列が得られた。 この微生物のゲノムDNAライブラリから遺伝子Aの全長クローンを取得するまでの流れを説明せよ』という問題です。 私の考えでは、 既知の塩基配列からDNAプローブを合成して、cDNAライブラリとハイブリッド形成させれば全長クローンを得られると思うのです。 しかしこの問題ではcDNAライブラリではなくゲノムDNAライブラリから得よとのこと。。 ゲノムDNAライブラリだと、 既知の塩基配列からDNAプローブを合成してハイブリッド形成させても遺伝子Aの一部とイントロン部分を得ることになり、全長は得られないと思うのですが… こういう場合は何か違う方法があるのでしょうか?? わかる方いらっしゃいましたら是非教えていただきたいです! よろしくおねがいします!!
- 締切済み
- 生物学
- TOPOベクタ-に入っているcDNAを制限酵素配列付加プライマーを使っ
TOPOベクタ-に入っているcDNAを制限酵素配列付加プライマーを使ってPCRで増やし、発現ベクターに入れたいのですが、色々と問題がありそうです。可能でしょうか? 遺伝子工学の初心者です。 2つ質問があります。どちらか一方だけでも良いので、回答よろしくお願いします。 (1)TOPOベクタ-に入っているcDNAを制限酵素で切り出すのではなく制限酵素配列付加プライマーを使ってPCRで増やし、発現ベクターに入れたいのですが、付加する制限酵素の配列がTOPOベクターに存在してしまっています。この場合、非特異産物がでてきてしまうでしょうか?このような手法は一般的ではないのでしょうか?ちなみに、コザック配列をつけるため(制限酵素配列-コザック配列-5´端相補的配列)のプライマーで増やそうとしています。 (2)制限酵素の切断効率を上げるために制限酵素認識配列の両端に数塩基余分な配列を入れるとプロトコルにかいてあり、プライマーの5´端は入れようと思うのですが、制限酵素認識配列の3´側にも入れる必要があるでしょうか? 切断効率は制限酵素認識配列の両端にある塩基の数が重要で、どの塩基かはそれほど重要ではないとか、そんなことはないですか?
- 締切済み
- 農学
- RT-PCRにおけるプライマー設計について
はじめてお世話になります。 通常のPCR時におけるプライマー設計は理解できるのですが、RT-PCRにおいては、はじまりが1本鎖のcDNAであるということでひっかかりを感じます。 cDNAの塩基配列がわかっていますのでそれをもとに遺伝子解析系のソフトを用いてプライマーを設計したところ、sense-primerの配列が、cDNAの相補鎖となるものと相補的になっていました。(anti senseのほうはcDNAと相補的だったのですが) 実験書を読むとsenseがまずcDNAとアニールして2本鎖になってから通常のPCRがはじまるというふうに理解できましたので、上記のプライマー設計ではPCRがおこらないということでしょうか? この場合はcDNAの相補鎖に対してプライマー設計をおこなえばよいのでしょうか。 それともこのままのプライマーでよろしいのでしょうか? よろしくお願いいたします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 配列決定について
いつもお世話になっております。 関連の本を読みましたが、よく分からなかった部分がありました。いくつか教えて下さい。 1. ゲノム配列を決定する際に用いるショットガン法では、ランダムに切断した断片をベクターに導入し、ベクターの既知配列部分をプライマーとして挿入断片の両端から配列決定していき、他の断片との重複から元のゲノム配列を決定する‥‥ことでしょうか。とすると、重複部分を生むために、もとのゲノムDNAは複数用いているのでしょうか?あるいは、ある一個のゲノムに対して、断片化から配列決定までの作業を行い、再度同じ作業を行なっているのでしょうか? また重複領域がみつからないと断片のつながりが分からないし、かと言って重複ばかりでは全体が見えないという点で、素人ながら効率が悪いようにも感じてしまいます。 2. cDNAの操作について 精製タンパク断片のアミノ酸配列からオリゴヌクレオチドプローブを作り、cDNAをスクリーニングして、精製タンパクの断片からプライマーを設計してPCRする例が私の教科書にはあるのですが‥‥スクリーニングできたcDNA入りベクターの既知配列(MCS?)をプライマーに使ってPCRするという方法は間違いなのでしょうか? 基本事項ばかりですいません。プロトコールのサイトや本をご存知の方、あるいは一部の回答でもかまいませんので、教えて下さい。
- ベストアンサー
- 生物学
- PCR決定法について
PCRでは、増幅したいDNAの端の塩基配列がわかれば、それと相補的なプライマーを作るとよいというふうに授業で習いました。 では、既知配列の外側領域の塩基配列をPCRを用いて決定したい時にはどうしたらよいのでしょうか? ーーーー「ーー」●○○○○○○●「ーー」ーーーー この「--」の塩基配列です。 ○の塩基配列は●をプライマーとすれば決定できるのはわかるのですが、その外側の塩基配列の場合のことです。制限酵素とかで切ったりしてやるのかなぁとも思うのですが、よくわかりません。。
- 締切済み
- 生物学
- RT-PCRについて
RT-PCRの質問です。 RNAからcDNAに逆転写するときに、Randam Primerと いうものがありますが、これってランダムにRNAに くっつくのですよね?だからいろんな長さのcDNAが できてしまうと思うのですが、Randam Primerを使っても 大丈夫でしょうか?Randam Primerの他に、オリゴdT Primer というのもありますが、どっちが逆転写に良いのでしょうか? あと、cDNAを増幅させるときのPCRで、遺伝子特異的な プライマーを使おうと思うのですが、1つのサンプルに センスとアンチセンスのプライマーを混ぜても大丈夫 なのでしょうか?あらかじめセンスとアンチセンスを 等量混ぜたプライマー液を作っといて、反応液に混ぜれば 良いのでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- 発現クローニング/cDNAクローニングについての問題がわからないので教えてください
生理活性の検出・測定は可能だが精製されていないタンパク質のcDNAのクローン化する方法を求めよ。 条件:そのタンパク質に対するmRNAはRNA溶液から単離できない。しかし、その組織のcDNAライブラリーの状態では各mRNAに対するcDNAはクローンとして単離できる。そして、あるcDNAクローンで対応するmRNAをRNA溶液から吊り上げることができる。 という問題なんですが 私は まず、RNA溶液のmRNAを全てプラスミドに組込み、培養し、できた各コロニーから大腸菌の活性を調べる(プラスミドに組込んだmRNAが発現するものと仮定する)。発現している目的のmRNAを組み込まれている大腸菌を取り出し、制限酵素により、mRNAを切り取る。mRNAを逆転写酵素を用いて逆転写してcDNAをクローニングする。 と考えたのですがこれができるのかわからないので、今回投稿させて頂きました。 これがあっているのか、または別の方法どちらでもかまいませんので、お分かりになる方は是非教えてください。
- 締切済み
- 生物学
- cDNAのクローニングについて
抗体Aと結合するタンパク質をコードする遺伝子(cDNA)をクローニングする方法を教えてください。 実はこれはある問題で、「PCR、アミノ酸配列、プライマー、精製、データベース」の用語を用いて説明するように書いてあるのですが、インターネットで「cDNAクローニング」といれて検索しても、詳しく中身が書いていなくて、よく分かりません。 自分なりに考えてみると、「タンパク質を精製して、そこからcDNAを抽出し、それをプライマーを用いてPCRで増幅させ、塩基配列を調べて、・・・。」 問題に答えているのか、合っているか分からないですし、行き詰まってしまいます。 タンパク質を精製する方法や、タンパク質からcDNAを抽出する方法があるのかも分かりません。 長々と書いてしまいましたが、よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- CD/DVDレーベル印刷がずれてしまう問題が発生しています。お使いの製品はブラザーのDCP-J926N-Wです。
- 問題の経緯や試したこと、エラーについて詳しく教えてください。
- また、お使いの環境に関しても教えてください。パソコンのOSはWindows10で、接続は有線LANです。関連するソフトはラベルマイティ17を使用しており、電話回線はひかり回線です。