納豆菌の培養をしているのですが・・・

質問

納豆菌を前培養として24時間培養し、その後大きな培養槽で本培養しようとしているのですが、前培養終了の段階で顕微鏡で見てみると納豆菌（桿菌）より明らかに小さい菌(？)が、僅かですがコンタミしています。
夏の始めごろまでは成功していたので、原因がよく分かりません。本当はコンタミではないのかもしれないと思い始めているのですが、とにかく考えられる原因、または解決法がありましたら教えていただけませんか？　よろしくお願いします。

ちなみに手順は以下の通りです。操作はクリーンベンチ内で行ってます。

(1)凍結保存していた納豆菌（粉末だったものをクリーンベンチ内で液体培地に混ぜて凍結したもの）をスラント（オートクレーブ後、殺菌灯をつけたクリーンベンチ内で固まらせたもの）に植菌し、シリコ栓をしてクリーンベンチから出し、30℃の恒温槽内で1日培養する。

(2)三角フラスコ内の液体培地（オートクレーブ後、殺菌灯をつけたクリーンベンチ内で冷やしたもの）に、スラントで1日培養した納豆菌を2白金耳植え、シリコ栓をしてクリーンベンチから出し、振とう培養槽で1日振とう培養する。

(3)振とう培養後の培地をプレパラートに少量取り、カバーガラスをかぶせて顕微鏡へ。

クリーンベンチやシリコ栓などは結構古いかもしれません。

回答No.3

oil-sour

＃２です。

ひょっとして、なのですが、粒というのは芽胞ではありませんか？

グラム染色されるかどうか、また芽胞染色をしてみたらどうなるか、検討してはいかがでしょうか。
ご存知だと思いますが、納豆菌を含むBacillus属は芽胞を形成します。
定常期に達した頃から徐々に芽胞形態が増え始め、３日ほどずっと培養していると芽胞だらけになっていきます・・・。

お礼

検討したわけではありませんが、ちょっと動いているように見えたので芽胞ではないと思っていました。
一応、今度試してみます。

回答No.2

oil-sour

(1)のステップでスラントの代わりに平板培地で画線し、シングルコロニーを本培養すればよいと思います。
このとき、納豆菌のコロニーだけをとります。凍結ストックの時点でコンタミがあれば画線した平板上に少なくとも２種類のコロニーが形成されるはずですから、顕微鏡で確認して納豆菌のコロニーだけをとります。
（納豆菌の培養経験はありませんが、なんとなくコロニー形成がすごく早いような気がするので、１日といわず16時間程度でよいかもしれません）

コンタミの原因は投稿の情報からではよくわかりませんが、シリコ栓はスラント作成と同時に滅菌していますよね？
あとは操作中のヒト由来だとしか思えません。
コンタミしているのはその小さな菌というのはどんな菌ですか？

凍結ストックから起こす時にスラントを使っている理由がよくわかりませんが、そもそもスラントは長期間固形培地上で培養しなければならないときに、ある程度湿度を保つ目的に使います。（増殖の遅い菌や、保存目的）
凍結ストックから菌を起こした時にコンタミを確認するのは鉄則といってもよく、平板培地で画線すればピュアカルチャーができるはずです。

お礼

シリコ栓も滅菌しています。小さな菌は高い倍率のレンズがなく、粒にしか見えないので何とも言えません。
平板培地での培養を試してみたいと思います。
どうもありがとうございました。

回答No.1

noname#194289

理想的と考えらえる装置に囲まれて実験しているように思われますが、凍結乾燥された納豆菌をそのまま液体培地で溶かしてというところが少し気になりました。自分で凍結乾燥したものなのでしょうか。実験の目的にもよると思いますが普通は大規模な実験の材料でしたら特に凍結乾燥されているものがほかの菌によって汚染されていないかを確認すると思うのですが・・・。また同僚先輩に聞いてみることができないのかとも思いました。装置や機材が古いかもしれないというのはこの際本質的なことではないと思います。

お礼

卒業研究なのですが、凍結は卒業した先輩がやったらしく、また連絡先とかもわからないので…
回答どうもありがとうございました。