遺伝子の化学合成法について

質問

はじめまして。生化学の研究室に所属している学生です。
自分の研究で、目的タンパク質をコードする遺伝子を化学合成によって取得し、発現ベクターに挿入した後、大腸菌等でタンパク質を発現したいと考えています。

方法として、目的タンパク質をコードするDNAを、いくつかのオリゴヌクレオチド断片として合成し、DNAポリメラーゼを用いてPCRによって構築するという概略は知っているのですが、詳細な方法が分りません。この方法が載っている文献（論文、参考書など）を知っておられましたら、教えてください。よろしくお願いいたします。

回答No.2

MIYD

ゲノムが手に入らずに、
ORF全長を合成したいということでよろしいでしょうか。

80mer程度のオリゴヌクレオチドは合成できるので、

1.ORF中央当りの配列80mer程度を両向き合成してアニーリング
2.Tベクターなどにクローニング
3.クローニングしている端15~20mer程度を3'側において、60mer程度外側に伸ばしたプライマーを合成
4.PCRしてクローニング
4.3に戻る

で一回のサイクルで80mer程度伸ばしていくことが出来ます。

病原性の菌の配列をあつかう場合、その一部の配列であっても、
P2~3レベルで、場合によっては大臣承認が必要になるかもしれませんので、注意が必要です。

お礼

実験の反応条件等が記載された文献を探していました。ご回答ありがとうございました。

回答No.1

MIYD

分子生物学の経験の無い研究室なのでしょうか。

まずは秀潤社の
バイオ実験イラストレイテッド第4巻
苦労なしのクローニング
をお勧めします。

お礼

化学合成を考えているのは、発現させたいタンパク質が、病原性を有するバクテリア由来であるため、培養することが出来ず、ゲノムも販売されていないためです。お勧めしていただいた参考書には、探している情報は載っていませんでした。ご回答ありがとうございました。