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RNAiについて
shRNAの発現ベクターで、お奨めのものがありましたら、教えてください。 INVITROGENのmiR RNAi発現ベクターにも興味があります。説明を読むと、プロモーターの自由度が高く、CMVなどのプロモーターが使えるとのことなので、発現が強そうな気がします。miR RNAiのデザインが、どのくらい信用できるのかも含めて、経験をお持ちの方がいましたら、教えてください。 http://www.invitrogen.co.jp/rnai/mir_rnai.shtml
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- transfe
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わたしはRNAi社提供の設計システム(http://haruka.sidirect.jp/esd/register.php)を利用しています。 実はここで設計したものを使ってshRNAを作成して利用していたのですが、 shRNAはmiRNAのパスウェイをかく乱するらしいという話を聞いて RNAi社のsiRNAを利用してみたところ、いい結果がでました！ 慣れてくるとshRNAよりもsiRNAのほうが手軽でよいように感じます。 効果の割りにお得感があったので、それ以降ずっとsiRNAです。
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- http://rnai.co.jp/
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入れたい細胞(入りやすさ)も、 入れた後何をしたいのか(検出限界以下にしたいのか、半分下がればいいのか) トランジェント、マスカルチャー、シングルクローンなどどの状態でアッセイしたいのかなどが書かれていないので、 奨めるベクター系が使えるのかわかりませんが、 http://alps3.gi.k.u-tokyo.ac.jp/~yamada/sidirect2/index.php?type=fc で設計して、pSUPER-retro-puroに入れて、 phoenix細胞でレトロウイルスを作らせて感染させるのは 結構うまくいっていました。 3個作って、2個か3個は半分以下になっていたと思います。 レンチウイルスシステム版ではないほうをリンクしているということは、 比較的トランスフェクションしやすい複数の細胞を使って、 ノックダウンのレベルを変えたときの反応を調べようとしているのでしょうか。
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補足
マウスでin vivo RNAiを計画しています。ウイルスベクターは都合により使えないので、shRNA発現プラスミドとsiRNAで比較検討したい思っています。本命は、siRNAなのですが、うまくいかない場合のバックアップとして、shRNA発現プラスミドを検討しています（in vivoでは、RNA deliveryよりDNA deliveryの方が容易と考えているので）。ノックダウンの程度は、phenotypeが出れば半分程度でも良いのですが、どの程度のノックダウンが必要かわからないので、目標７５％以上です。ノックダウンの期間は、3日から最長１週間くらいを考えています。持続しない場合は、マウスに連投します。 当方、vitroのsiRNAは経験ありです。