蛍光免疫染色について

質問

今、hMSCの一重染色をしていますが、ほとんど染まりません。固定液は4%パラホルムアルデヒドで10min、第一抗体はanti-β-Galactosidaseで4℃でO/N（濃度は1000～4000倍希釈）、第二抗体はAlexa 594 anti mouseIgG2a（濃度は500～1000倍希釈）を使っています。固定液を希釈し、抗体濃度をあげたら多少は染まっているような気がしますが、気がする程度です。染まるコツがあったら教えてください。

回答No.2

bzxjpjp · ベストアンサー

確認ですが、Tritonなどで細胞膜を透過性にしていますよね。
あとは、geneticist12さんがおっしゃている、二次抗体が一次抗体のサブクラスと一致していないことが考えられると思います。

補足

geneticist12さん、bzxjpjpさん、ご指摘ありがとうございます。一次抗体のサブクラスを確認したところ、二次抗体と同じ、anti mouse IgG2aでした。また、Triton-Xを使用しています。

回答No.1

geneticist12

念のため確認しますが、２次抗体がサブクラス特異的になっていますけれど、一次抗体のサブクラスと合っていますか？　一次抗体がポリクロならサブクラス特異的二次抗体は使わない方がいいです。