• 締切済み

酵素が樹脂にくっつかないんですよ~(*_*;)

MIYDの回答

  • MIYD
  • ベストアンサー率44% (405/905)
回答No.1

たんぱく質精製はあまりちゃんとやったことが無いのですが、 最初の時点でアグリゲートして不溶性画分にきているのではないことは確認できているのでしょうか。 ゲルろ過の前後での酵素活性(もしくはWBでの検出)がどの画分にきているのかは確認されているのでしょうか。 ゲルろ過で分けられないというのはvoid volumeに出てくるという意味でしょうか。 それとも落ちてこないという意味でしょうか。

参考URL:
http://biochem2.umin.jp/contents/Manuals/manual01.html
hellofabio
質問者

補足

ご回答ありがとうございますm(_ _)m  最初の時点では活性が可溶性画分で測定できてるんで可溶性にきてると思います。不溶性画分にきてないかどうかは、巻き戻したりして確認したわけではないですし、SDS-PAGEなんかして確認もできないので(原株なんで発現量も少ないですし、なんせ分子量すらわかってない酵素なんですよ(*_*))はっきりとはわかんないです。  ゲルろ過で分けられないのは、結構汚ーい酵素液流してるんですが、1ピークになっちゃうんです(質問で書かせていただいたように茶色い成分と一緒に)。。。ブルーデキストランとほぼ同じ位置なんですよね。もちろん樹脂の詰まり具合が問題というわけでもなく(ちゃんと詰め替えたし、HPLCでも同じ結果・・・)、このピークに活性もちゃんとあるんですよ(*_*)あーほんとに ・゜(PД`q。)・゜ドウシタライイノってかんじです。

関連するQ&A

  • 酵素の精製

    疎水性の高い酵素を精製をしています。 しかし、陰イオン交換カラム、疎水性のカラムにもほとんど吸着しません。タンパク質のアグリゲーションを疑っていますが、アグリゲーションだと証明する方法を教えて頂けないでしょうか?もし、アグリゲーションなら、それを防ぐ対策も併せてお教えください。 使用している酵素は、大腸菌JM109を宿主として発現させた酵素です。外部分泌酵素ではありません。

  • 両イオン交換樹脂の再生

    陽イオン交換樹脂の再生にはHClを、陰イオン交換樹脂の再生にはNaOHを流すのは分かるのですが、両イオン交換樹脂の再生はどのように行えばよいのでしょうか?陽イオン交換樹脂を再生するためにHClを流すと陰イオン交換樹脂がCl-に置換されてしまいますし、陰イオン交換樹脂を再生するためにNaOHを流すと陽イオン交換樹脂がNa+に置換されてしまいます。どのように行えばよいのでしょうか?

  • 酵素と酵素反応に関して

    どうしてもこれらの問題が分かりません(>_<);; 以下の記述に誤りがあります。 1.動物細胞由来の酵素には、反応の至適pHが酸性のものはない。 2.基質分子と酵素たん白質との結合は、主にイオン結合である。 3.酵素反応の最適pHは、酵素たん白質の分子量により決まる。 4.反応液中の塩濃度は、酵素反応の最適温度には影響をあたえない。 どこがどういう理由で誤っているのか教えてください! どれを調べても載ってませんでした。;;

  • イオン交換樹脂の吸着挙動が変わる要因がわかりません

    大学でイオン交換樹脂に関する実験のレポートを作製するに当たって、以下の点がわかりません。 強塩基性陰イオン、強酸性陽イオン交換樹脂のpH領域を1~13までふってコンディショニングを行った後、各phの金属溶液を用いて試験を行いました。 そして試験後の溶液を定量して吸着分配係数を出したのですが、強酸性陽イオン交換樹脂の試験結果はph2とph7付近という、2点で高い吸着分配係数を示しました。 吸着にかかる要因は官能基だけなので、ピークが2点出るとことは「ない」のではと考えているのですが、ピークが2点出ることはあり得るのでしょうか? また、仮に出ることがあり得るようでしたら、その要因も教えて頂けないでしょうか?

  • イオン交換クロマトグラフィー

    現在、大学でタンパクの精製を行っています。 疎水クロマト、陰イオン交換クロマト、ゲルろ過の順番で行ったのですが、まだ精製しきれていません。 そこで、陽イオン交換クロマトも間にいれてやってみようかなと計画しています。 そこで疑問に思ったのですが、陰イオン交換クロマトと陽イオン交換クロマトと続けて行っても大丈夫なのでしょうか? 自分の考えではいらないタンパクが除去されて上手くいくかなと思っています。 過去に前例などがあればそちらの紹介もよろしくお願いします。 足りない点は補足いたしますのでよろしくお願いします。

  • イオウ交換樹脂について

    陽イオン交換樹脂として(アンバーライトIR120BNA) 陰イオン交換樹脂として(アンバーライトIRA410JCL) を使用して実験しました。 これらの、樹脂のイオン交換しやすいイオンを教えてください。 また、アンバーライトの後の英数字の意味を教えてください

  • たんぱく質の精製・構造解析について

    現在抱えている課題の中で本当にどこから手をつけていいのやら悩んでしまったものが..... 【あるたんぱく質Aの生物的活性を保ったままに精製し、一時構造を解明する実験の手順を考えよ。 ただし3回の条件の異なるイオン交換クロマトグラフィを必ず行うこと。】 というものです。 タンパクの性質は大体要約すると 分子量約90,000、細胞質に分布 等電点7,5付近 SDS-PAGEで45,000 硫安濃度40~60%に分画 pH3以下で失活、6~8,5ぐらいで安定  pH8,2での陽イオン交換クロマトで0,1M NaClで溶出 pH6,5での陰イオン交換クロマトで0,05M NaClで溶出 たんぱくAはある酵素で、化合物Zにも結合できる、しかしZはほかの多数のタンパクにも結合してしまう。 Zに結合する他のタンパクは、イオン交換クロマトで除ける。 【使えるもの、機材】たんぱくAと特異的に反応する抗体1・2 抗体1と結合した担体(A)  Zと結合した担体(B)  各種実験に必要なものはすべてある 大体はこんなところです。タンパクAは実際にはないもののようです。 自分でも考えてみたのですが、とりあえずどこからはじめればいいのかまるで見当がつきません!! だいたいの流れだけでもわかる方、ぜひ教えていただけないでしょうか。 よろしくお願いします!!

  • タンパク分解酵素は分解されないのですか?

    使用しているコンタクトレンズ洗浄液のラベルに 「主成分/タンパク分解酵素、陰イオン界面活性剤」 という表記があるのですが、これが疑問に思えてなりません。 「タンパク分解酵素」の働きはタンパク質の分解です。 「タンパク分解酵素」そのものも、酵素ですからやはり 「タンパク質」から出来ているはずです。 ということは、洗浄液ボトル内のタンパク分解酵素は 同じくボトル内にいるタンパク分解酵素を どんどん分解していってしまうのではないでしょうか? こうしている間にもバラバラのアミノ酸になって、 洗浄液としての働きを失ってしまうのでは?

  • イオン交換クロマトグラフィー (どちらの交換体使うのか。)

    等電点8.5のたんぱく質を精製するためにこのたんぱく質をカラムに吸着させなければならない。このとき使うイオン交換体は陽イオン、陰イオンどちらの交換体がよいか? という問題はどういうふうに考えればよいのですか。緩衝液の最初のpHとかは考えなくてよいのでしょうか。  私は陽イオン交換体なのかなと思ったのですが、自信がないので、わかる方がいらっしゃいましたら詳しく教えてください。

  • イオン交換クロマトグラフィー

    イオン交換クロマトグラフィー(陰イオン交換体)について質問させてください。 吸光度とpHのグラフを作成しました。 そこで、このグラフより、どのpHであるタンパク質は陰イオン交換体(樹脂)に吸着したかを考える上で、グラフのどの部分から分かるのですか? また、その理由をおしえてください? あと、そのグラフから、あるタンパク質の等電点を求めるにはどのようにすればよいのですか?