グラム染色をしたのですが・・・

質問

こんにちわ。
培養した菌をグラム染色しました。
以前にも行ったことがあるのですが、そのときとは顕微鏡で見たときの様子がかなり違ったのです。

サイトを見て調べたところ、グラム陽性菌であったならば濃青色に染まるとありましたが、今回は菌が薄い青色となりました。教わった手順を踏まえたはずでしたが、例えば1種の溶液での染色時間が長すぎた場合などは、結果として状態が変わってしまうものでしょうか?
また、顕微鏡の倍率は100～1000倍程度で、1000倍で観察する際は油膜法を用いるとありました。しかし観察時は光学顕微鏡で5600倍としてしまいました。この倍率でくっきり見えていたのですが、観察しなおした場合、1000倍で油膜法を用いずとも見える可能性はありますでしょうか?

今回、マニュアル本などを見ての実験ではなく、教わった事をノートに書きとめておいた手順での操作だったため、特に顕微鏡に関しては初めて一人で行ったため、かなり勉強不足です。
何卒アドバイスよろしくお願いいたします。

回答No.2

パブクシャンnoチビ枯淡（@tibikotan） · ベストアンサー

油膜法とは『エマージョンオイル』を100倍の対物レンズと、
スライドグラスの間に滴下しての顕鏡のことをではないのですか？
高倍率の油侵系対物レンズの場合には、
光線が対物レンズと資料の間を油滴が通過するように
屈折率が設計されていますので、非常に悪い画像しか得られません。

わたしの顕微鏡：オリンパス　BH-2で
対物レンズ：オリンパス　D Plan 100 1.25 oil 160 / 0.17
接眼レンズ：オリンパス　WHK 10×/20 L
を使用していますが
オイルを滴下せずにおこなう顕鏡観察にはまったく耐えません。

また光学顕微鏡では光学的に、
5600倍の倍率では有効な画像が得られる訳がありえませんが？
光学顕微鏡では1000倍が使用に耐える限度と考えられています。

厳密な結果を求めるには、染色剤：試薬の鮮度と製造に非常に神経をつかいます。
他との比較には規格どおりの試薬と厳密な染色手順が必用です。

今夜は詳細を記述する時間がありませんが、
厳密な試薬の製法と技術的なことが知りたければ後日にお知らせします。

お礼

大変丁寧な回答ありがとうございました。
お礼記入がすっかり遅れしまい、大変申し訳ありませんでした。

油膜法で画像が悪くなるとは逆に驚きました。
「この方が見やすいから」という理由からと思っておりましたので勉強になりました。

染色に関しては市販の染色剤を用いて行いました。
瓶には使用期限が記入されていなかったのですが、試薬の鮮度に気を使わなければいけないということは染色剤の消費期限が切れていた可能性がありますよね…
(使用期限切れても染まるよ、と教えてくれた方がいたので、そんなに大きく影響しないものかと思ってしまいました。)
最終的に菌と染色液の鮮度、また何度か菌の懸濁具合を変えてみましたら、うまくいきました。

たくさんアドバイスくださいまして本当にありがとうございました。
回答してくださいましたのに返信を怠ってしまい、申し訳ありませんでした。何卒非礼をお許しください。

回答No.3

kazu-nori

グラム染色による菌の染まり方は、同じ菌であっても使用した培地の種類、培養温度、培養時間などで変わります。
分類書で陽性となっている菌でも、培養時間が長い培養物では染まらないことはよくあります。基本的に新鮮な培養物を供試することが必須です。また、スライドガラスに菌体を多く盛ってしまうと、脱色が完全にできず、陽性に見えることもあります。
もちろん、染色の手際や染色時間の長短でも結果は変わると思いますが、数十秒程度の差ならあまり影響しないと思います。
あと、「劉の反応」といってKOH水溶液でグラム染色性を簡易的に確認する方法もあります。

光学顕微鏡の倍率に関して、5600倍は？です。(^_^;)

お礼

グラム染色に関する回答ありがとうございました。
返答記入が遅れまして、大変申し訳ありませんでした。

菌に対しての扱いでそこまで変わることがあるのですね。
バクテリアならば24時間以内は新鮮という判断ができると聞いておりましたが、培地で増殖したらすぐに使用するなどいろいろと試してみました。
また、スライドグラスへ移す菌体の量も変化させてみたところ、まともに見れる状態になりました。

詳しいアドバイスをいただきまして本当にありがとうございました。
回答に対する返信を怠ってしまい、申し訳ありませんでした。何卒非礼をお許しください。

回答No.1

Dr_Hyper

一般に染色は色素の取り込みや化学反応でしょうから、染色時間は他が全く同一であれば重要なファクターだと思います。ただ色が薄いようですので、むしろ他が原因ではないでしょうか。

顕微鏡についてですが、5600倍はすごいですが。。
いずれにせよ、油膜法を用いるか用いないかは、その顕微鏡の対物レンズによります。焦点深度を稼ぐ為にオイルを入れるので、一度対物レンズの種類を確認されればいいかと思います。

お礼

回答ありがとうございます！
染色時間以外に変化させたことですと、初めにガラスプレート上で作成する菌液の量かと思います。どの程度がちょうどいいのかは、染色してみないと分かりづらいと感じたのですが、回数をこなしていくうちに感覚つかめますでしょうか?

やはり顕微鏡は聴いたことない倍率ですよね；オイルを入れる理由、ありがとうございました。対物レンズによるということは油膜法専用いうことですね・・・確認&検討してみます。

お忙しい中ありがとうございました!