ELISA 二次抗体の使用に関して

質問

大学の研究室でELISAをするにあたり新しく購入した二次抗体を使用することになりました。
そこでまず二次抗体の検定を行うことになり、まず96wellプレートに2段階希釈した血清を吸着させ、wash、ブロッキング、washをしたのち2段階希釈した二次抗体を分注し、ABTS基質で反応させてOD値を測定しました。

その結果ある一定の血清希釈倍率まで、血清の希釈倍率が上がるほど(濃度が低くなるほど）OD値は上昇しました。

予想では血清の希釈倍率が増加するほど血清は薄くなるので、反応する二次抗体量も少なくなり、OD値は減少するはずでしたが予想外の結果となりました。

なぜ血清の希釈倍率が上がるほどOD値は上昇するのでしょうか。

吸着させる血清が多すぎると血清同士で二次抗体の反応を阻害してしまうのかとも考えましたが二次抗体分注前に、しっかりwashしたので余分な血清は残っていないはずです。

うまく説明できず申し訳ありませんが回答お願いいたします。

回答No.2

yuklamho

もしかしたら、希釈に使われたバッファーに何か入っていたのかもしれませんね？血清を入れなかったブランク（バッファーだけ）のOD値はどうっだったのでしょうか？
因みに、使われた血清は何の血清で、二次抗体の方は何に対する何の二次抗体ですか？

回答No.1

trytobe

新しい二次抗体だけでも濁っているなど、OD値がある（バックグラウンドが高い値）だからではありませんか。

つまり、ブランクでも OD値が高く、OD値の測定＆プロットでは結合性の評価ができない、と。