- ベストアンサー
シーケンスについて
論文にあるプライマーを用いてPCRおよびシーケンシングを行ったのですが、 Forward側とReverse側の配列が重ならず、一本の配列にすることができません。 PCRの条件は参考にした論文と同じで、対象とする分類群も一緒です。 どのような理由が考えられるでしょうか。 よろしくお願い致します。
- みんなの回答 (3)
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
- ベストアンサー
その他の回答 (2)
- yuklamho
- ベストアンサー率26% (305/1156)
関連するQ&A
- DNAシーケンス
DNAシーケンスがうまくいきません。 800bpのPCR産物をTベクターに組み込んでおり、M13ForwardとM13Reverseのプライマーを使用し、両方向からシーケンスしています。 M13Reverse側からはうまくシーケンスできるのですが、M13Forward側からはうまく読めません。 同じプライマーを使って、ほかのプラスミドをシーケンスするとうまくいくのですが、このサンプルはForward側から読めません。 使用しているシーケンサーはABI3730 キットはBig Dye V3.1です。 サンプル量、プライマー量はキットで推奨されている量を使用しており、Big Dyeは1/4希釈です。 何度シーケンスしても読めないのですが原因は何が考えられるでしょうか。また、、何か解決策はあるでしょうか。
- ベストアンサー
- 生物学
- TAクローニング後のシークエンスに関して教えてください。
TAクローニング後のシークエンスに関して教えてください。 生命工学の分野で実験している大学生です。 現在、遺伝子のクローニングを行っています。 ある生物由来のRNAからcDNAを合成し、cDNAをテンプレートとして約1000bpの目的遺伝子をPCRにて増幅、増幅断片をTAクローニングでTAベクターに入れました。 インサートの確認をするため、ベクタープライマーでシークエンスをしましたが、その配列の解読に困っています・・ フォワードのプライマーで読んだ配列は、目的遺伝子配列の相補鎖となっていました。これで、3'側が900bpほど確認できました。しかし、リバースのプライマーで読んだ配列がどうなっているのかよくわかりません・・。 TAクローニングではインサートが逆向きになることがあるとのことですが、これはそのケースでしょうか?その場合、リバースプライマーで読んだ配列はどのような配列になるのでしょうか? 初投稿で読みにくい、説明不足な点もあるかと思いますが回答よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- PCRの 5’・3’ が分からず困っています
PCR で使われる5’と3’の表記で困っています。 実習でPCRとプライマーの設計デモをやりました。ソフトウエアを使ってプライマーを設計すると、いくつか候補が出ます。これは、3―・・・ ―5’で表示されるのが一般的だと教えられました。実際の実習では、既に準備されたプライマーを使ったんですが、プライマー合成した会社からの詳細コピーも配られました。そこには5’―・・・ ―3’と明記されており配列は同じでした。もし、5’―・・・ 3’の方向で書くのら、配列はソフトウエア上で出たものとは逆になるはずでは?設計デモの時、チューターからは「プライマーの始まりはGCリッチに」とも言われました。3’末端の配列はGかCが望ましいという条件があることから考えると、やっぱりプライマーの始まる方を3’として、配列は、3’―・・・ ―5’で記載するのが一般的なのだろうなと想像してます。 よく本には以下のような模式図が出ています。 5’―・・・ ―3’ 3’―・・・ ―5’ の2本鎖が熱で、5’―・・・ ―3’ と3’―・・・ ―5’ という1本鎖に別れる。で、5’―・・・ ―3’ の鎖では 鎖の3’側へ 5’―・・・ ―3’ のプライマー(これがリバースプライマー!?)がくっ付いて、プライマーの5’を起点にして5’→3’方向へDNAが合成される。 3’―・・・ ―5’ の鎖でも 鎖の3’側へ 5’―・・・・ ―3’ のプライマー(こっちがフォワードプライマー!?)がくっ付いて以下同様。 だとしたら、プライマーの配列が3’から記載されるのはおかしいと思うのですが。 プライマーの配列そのものの向きではなく、プライマーがアニールするテンプレートの配列を基準に 3’と5’を考えているということなんでしょうか?
- ベストアンサー
- 生物学
- PCRプライマーの保存について
PCRプライマー(非修飾)をセットで保存することは問題ないでしょうか (つまりフォワードとリバースを一緒にということです。)? PCR反応の最初のステップで95℃で5分のステップを行っていれば、 プライマダイマーを作ってしまったとしても問題はないと思うのですが
- ベストアンサー
- 生物学
- シークエンスでプライマー配列部分の塩基は決定可能?
PCR産物をダイレクトシークエンスする場合、塩基が決定できるのはプライマーで挟まれた部分の配列についてで、プライマーがアニールするはずの部分(プライマー配列に含まれる部分)の塩基は決定できないという認識でいるのですが、正しいでしょうか? 実は、最近読んだ国際誌(Molecular Ecology)の論文で、(そのPCRに利用したと明記されている)プライマーがアニールするはずの部分の塩基を決定し、そこにたくさんの多型(全多型の約20%)を検出しているのをみて不思議に思った次第です(GenBankにも同様の配列が登録されていました)。 プライマー配列部分にプライマーと異なる塩基があれば、その部分がヘテロのピークとして現れることがあるとは思うのですが、このようにして得られた塩基は信用していいのでしょうか?また、ヘテロが現れなったからといって、その部分の対象の配列がプライマーと同一としていいのでしょうか? メジャーどころの国際誌に出ているのだから問題ないと思わないでもないのですが、配列のローデータにまであたらないと分からないわけですから、見落されていたということもありえると思うのです。 ご意見のほどお聞かせいただければ幸いです。 どうぞよろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- プライマーについて
初めて生物分子実験をした初心者です。 先日、大腸菌を形質転換(GFPを導入したもの)からプラスミドを調整し、そのプラスミドを鋳型としてPCRを行い、EGFP配列の増幅を行いました。用いたプライマーは、 forward 5'(GTGCTAGC)TGTGGAATTGTGAGCGGATA 3' reverse 3' (TACTCGA)GTCACCGTCATCACCGAAAC 5' です。 ()内の配列はEGFPにはなく、先生がプライマーに付け足したものです。その細工には理由があるとのことなのですが、()内の配列がなくても増幅出来るのに、なぜ付けたのか分かりません。 どなたか分かる方がいたら教えて下さい。よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- ロングプライマーでのPCR
通常のPCRは20mer程度のプライマーで行います。しかし、現在実験の過程で70merのプライマーを使ってPCRをしようと考えています。これほど長いプライマーでPCRは可能でしょうか。また、可能ならPCRを行う段階での注意点を教えていただけないでしょうか。ちなみに、TM値を計算したところforward、reverse共にTM値が71でした。
- 締切済み
- 生物学
- ダイデオキシ法におけるプライマー配列について
ダイデオキシ法におけるプライマー配列の設計は、フォアードプライマーは、目的の配列の3'→5'の前方に結合するように、リバースは相補鎖の5'→3'の向きで結合するように設計しますが、疑問があります。 (1)ダイデオキシ法は、普通のPCR(設計したプライマーで、はさまれた間が増幅される)と異なり、元のDNA鎖に何度もプライマーが結合し、その後にddNTPが結合して順番に塩基が読めるものと理解していて、出来上がった遺伝子断片に再び、プライマーが結合することはなく、もとのDNA鎖のみに何度も結合していくのですよね?この理解は正しいのでしょうか? (2)読めた配列のデーターに、プライマーの配列も読めるのでしょうか? プライマー以降にddNTPが結合していくので、プライマー自体は配列が読めない気がします。しかし、出来上がったプライマー+目的の配列を持ったDNA鎖に相補的にまたddNTPが結合すると、プライマーを含めた目的の配列が読める気がします。プライマーがなくてもddNTPは相補的な配列をもったDNA鎖に結合することができるのでしょうか?プライマーが結合し、そこからポリメラーゼが来て、dNTPを使って伸長反応をするので、プライマーがなくてもddNTPが結合して配列が読めるというのは間違っていますよね?設計したフォアードの配列がシークエンス結果の配列にあってなぜ読めるのか不思議になりました。 (3)伸長反応は酵素にもよりますが、全長は伸びず途中までしか読めないことから、シークエンス解析では、フォワードとリバースをプライマーに用意しますが、疑問があります。リバースを用いて読めた配列を反転し、フォワードを用いて読めた配列と結合するのは、機械が自動的にしてくれるのでしょうか? 頭がこんがらがってしまい、困っています。どなたかよろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
- リモートデスクトップとは、ホストPC上に仮想マシンを作り、クライアントPCから遠隔操作する方法です。
- VNCとは、ネット経由で他のPCを遠隔で操作する方法で、操作者はOSを共有します。
- リモートアクセスとリモートデスクトップは、VNCとリモートデスクトップの対比を指します。
お礼
周りにアドバイスをいただける人がいなかったので質問させていただきました. 丁寧な回答本当にありがとうございます. とりあえず、内側にプライマーを作成することで確実につなげていこうと思います. 本当にありがとうございました.