PAGEについての質問
- グリコールキトサンを組み込んだPAGEとは、ゲル中の成分として含むことですか？
- ゲルはクエン酸緩衝液で37℃、1h(粗)、2h(精製)でインキュベートし、キトサナーゼ活性で染色したということでしょうか？
- 5%酢酸で紺色に着色する原理はどのようなものでしょうか？
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ＰＡＧＥについての質問
Glycolchitosan (0.05%, w/v) incorporated PAGE was performed at pH 8.8. 「グリコールキトサンを組み込んだPAGE」 は、ゲル中の成分として含むということですか？ The gel was stained for chitosanase activity by incubating at 37 °C for 1 h (crude enzyme) and 2 h (purified isozyme) in 0.1 M citrate buffer, pH 3.0, washed with distilled water and stained with Congo red (0.1%). 「ゲルはクエン酸緩衝液で３７℃、１ｈ(粗)、２ｈ(精製)でインキュベートし、キトサナーゼ活性で染色した。」 ｈは時間で、泳動した後のゲルについて各々酵素反応を行ったということでしょうか。 The contrast was enhanced for the development of dark blue colour with the addition of 5% acetic acid where chitosanase activity band was observed as a clear area against a dark blue background. 対照は、5%酢酸で紺色を付け、活性バンドは紺色ＢＧに対し、透明帯として観察した。 ５％酢酸で紺色に着色するのはどういう原理でしょうか？ ペクチナーゼの方ではルテニウムレッドを用いて ピンク色のＢＧに対して透明帯を観察したと 書いてあるのですが、これも５％酢酸によって ピンク色に着色したのでしょうか？
- rheart
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- 生物学
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研究室の論文紹介会で使う論文の和訳として知りたいのか、この実験をするのに実験方法を知りたいのかわからないのですが、 chitosanase activity を測定する方法。MMP(gelatinase)activityを測定するgelatin zymographyと同じ原理です。 Glycolchitosanはchitosanase の基質として、ゲルを作成するときに添加する。ゲルのpHは 8.8。その後、PAGE（電気泳動）をする。chitosanaseは何kDaかは知りませんが、PAGEによりタンパクが分かれ、chitosanaseの分子量に合った位置に分画される。 次にクエン酸緩衝液中にゲルを入れ反応させる。つまり緩衝液中でchitosanaseが活性化され、Glycolchitosanを分解する。泳動後、ゲルを反応させるので、crudeを泳動したゲルに対しては1時間、purifiedを泳動したゲルに対しては2時間反応させる。 反応後、ゲルをCongo red で染色、Glycolchitosanが染まり、chitosanaseがある位置にはGlycolchitosanが分解されるのでCongo red では染まらない。透明なバンドになる。 コントラスト(濃淡）をはっきりさせるために、酢酸（pHを酸性にし）を加え、赤から青にする。 なぜ、Congo red が酸性下で青色になるかは知りません。
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お礼
判りました。 具体的にありがとうございます！
補足
酵素染色の流れは判りました。 判りましたと言っておいてなんですが、 Congo red が Glycolchitosan を赤く染色して 酵素反応が起こった部位が透明になるというのは、 どうも妙な気がします。 加水分解酵素なので、 多量体の Glycolchitosan を分解しても オリゴ糖程度の Glycolchitosan が残りそうなので これらが染色されずに透明だというのは・・・？ どういう原理なのでしょうか？