アガロース電気泳動の実験について質問です。

質問

アガロース電気泳動の実験について質問です。
実験を行った結果、小さな断片が出てこなかったのですが、それはどうしてなんでしょうか？
また、それを確かめる方法はあるでしょうか？
お答え、宜しくお願い致します。

回答No.1

sewingcough · ベストアンサー

おそらくDNAをアガロース電気泳動したのだと思いますが、
理由は3つ考えられます。

(1)小さい断片は非常に速く流れるので、
流れきってしまった可能性があります。
（ゲルの下の方にスメアなバンドがあるかも）
この場合、アガロース濃度を濃くしてください。
また、できれば小さい断片用を使った方がいいです。
濃度としては、200bp以下ならば4-5%、
200-400bp程度なら3%くらいかと思いますが、
使ってるアガロースにもよるので、
何回か試して感覚をつかんでください。
あるいは、あまりにも小さい断片だったら
ネイティブページで見た方がいいかもしれません。
また、大きい断片と小さい断片を同時に見るのは
結構難しいので、二つに分けるか、
あるいはネイティブページでグラジエントゲルを
使ったら見えるかもしれません。やったことないですが・・・

(2)もしゲルに問題が無いならば、
サンプル濃度が薄いかもしれません。
一般に大きい断片よりも
小さい断片の方が染まりが薄いです。
ですので、小さい断片を見る場合は
いつもよりずっと多い量を流す必要があります。
可能ならばサンプル量を2-3倍にして、
エチブロへの浸漬時間を倍くらいにするといいかも？
（エチブロ入りのバッファで泳動してる場合
　浸漬時間は関係ありませんが・・・）

(3)あるいは、一本鎖DNAを流してたりしませんか？
一本鎖DNAはバンドがスメアになるので、
やはり量を多めに流す必要があります。

他の理由もあるかもしれませんが、ちょっとわかりません。
役に立たなかったらごめんなさい。

お礼

ありがとうございます。
大変参考になりました!
これで、レポートが片付きそうです<(_ _*)>

回答No.2

stringf35

実験の詳細がわからないと何とも言えませんが…

制限酵素処理後に小さな断片が出るはずが、出なかった場合：
（１）エチジウムブロマイドやSYBR Safeなどの色素でDNAを見ていると思いますが、DNAが長いほど多くの色素が結合するので、同じモル数のDNAでも、鎖長が長いほど濃いバンドになります。ですので、数十bpなどの短いDNA断片は、大量にないと見えないことがよくあります。この場合、量を増やせば見えるはずです。
（２）アガロースゲルの組成が適切かどうかを確認してください。小さな断片を0.5%アガロースで見ようとしても流れ切ってしまうので見えません。2%アガロースとか、アクリルアミドゲルで泳動するべきでしょう。

PCR後に小さな断片が出るはずが、出なかった場合：
（３）上記（１）と同じ可能性が考えられます。
（４）PCRがかかっていない。この場合は、PCR条件の見直しやプライマーの再設計が必要でしょう。

お礼

詳しく教えて下さり、ありがとうございました。
レポートを書く参考にさせて頂きます！