HPLCの保持時間のバラツキに関して

質問

HPLCの初心者ですが、最近防腐剤（パラベン）の分析を行っています。複数のパラベンを一緒に混ぜて各パラベンの保持時間を確認しようとしていますが、どうしても保持時間にバラツキが生じます。同じ溶液でしたら、保持時間も同じだと聞いたことがありますが、このバラツキが生じる原因はなんでしょうか？保持時間のズレはどれぐらいまで許容範囲ですか？　教えてください。

回答No.3

caesart

No.2です。
移動相はほぼ脱気しない

移動相は「脱気するべき」ものです。溶媒と水を混ぜると中に空気が溶け込んで、それがHPLC流路の中に出て行きます。ポンプがエアをかむと圧が変動して、流速が不安定になり、保持時間のずれが生じますし、検出器のセルに空気が入ると測定できません。移動相を調製後ヘリウム脱気か超音波脱気で溶存酸素を除去するべきです。

一回測定終わったら、流量を0.2ml/minに変更します。測定する場合は0.7に設定し直します。

まさかと思いますがこれは、標準溶液を0.7ml/minで測定して、標準品ピークが全部出たら流量を0.2にして、次の注入をする前に0.7にして注入する・・・と言うことでしょうか？
何故変えるのでしょう？
通常一連の測定が全て終了するまで流速は変えないものです。
同じ移動相でもポンプやセルの安定の問題があるので、同じ移動相でも標準品と試験品の注入の間に流速を変えるのはよくない・・・というか、「そらー保持時間もずれるよな」と思います。
「追い出し」をするために流速を「上げる」ことはあるかもしれませんが、そのときは次の注入を行う前に測定条件の流速で15～30分（ちゃんと機器やカラムが安定するまで）流すべきです。

質問者様のHPLCがどのようなものか、分かりませんが普通の（セミミクロ等ではなく4.6φ前後のカラムを使う）HPLCでは
・移動相は脱気する（HPLCが脱気してくれるなら別ですが・・・）
・不必要に流速をいらわない
はお約束ですよ。

メーカー等の講習会に参加されてみてはいかが？

お礼

いろいろ教えて頂いて有難うございました。
今度、ぜひ教えて頂いた通りにやってみたいと思います。

HPLCの本とか買って読んでいますが、やっぱり分からない部分もあって、講習会に参加したほうがよさそうですね。

もう一回有難うございました。

回答No.2

caesart

同じ溶液でしたら、保持時間も同じ

これが移動相のことを言っているのであれば、ほぼ正しいでしょう。
しかし、移動相を作り変えたときに微妙に組成が変わって保持時間がずれることはよくあります。一般に逆相HPLCの場合、溶媒量が多くなれば他の条件が同じでも、保持時間は早くなります。
毎回「全く同じ」には作れないので、移動相を調製し直した時は保持時間を確認するべきです。

移動相ではなくて「同じ溶媒」で調製した濃度の違う標準溶液の場合、極端に濃度が違うと保持時間がずれる場合があります。ピークが左右対称でない場合によく起こりますが、（私の経験では）パラベンならそこそこ一致すると思います・・・（でも機器やカラムにもよるかも）
多分ODS系のカラムを使用されていると思いますが、他のメーカーや同じメーカーでも違うシリーズのもので試してみるのも一案でしょう。意外と「相性」があるものです。

0.3～0.5minのずれは微妙かな。以前0.5～50ppmで検量線を立てていましたが0.8minもずれなかったと思います。

蛇足ですが、ワークステーション等のプログラムで自動認識をさせているなら、「同定幅」を広めに取った方がいいかと思います。（このままで行くとして）
その場合「実はパラベンではない」物質をプログラム上「検出」してしまうので、確認試験（他波長検出器でスペクトルを見るとか、単波長検出器なら、波長を変えて再測定する、場合によっては移動相組成も変えてみる・・etc）等の「用心」をされることをお勧めします。（保持時間があっていても実施した方がいいことですが・・・）

個人的にはポンプ圧が5.2～5.5というほうが気になります。同一測定中に変動してもせいぜい0.1くらいです（経験上）・・それとも例えば昨日は5.2で今日は5.5でしょうか？
移動相の脱気は十分ですか？プランジャー、プランジャーシール等は劣化していませんか？

お礼

ご返答本当に有難うございました。
毎回移動相を調製し直した時は放置時間を確認するべきですね。
同定幅も広めにして取ってみます。

HPLCは１週間に一日だけ起動しますが、その場合、移動相の流量は0.7ml/minで作動します。一度に移動相を800mlぐらい調製するので、二週間使います。（二日）
ポンプ圧ですが、一回測定終わったら、流量を0.2ml/minに変更します。測定する場合は0.7に設定し直します。その時に最初の測定で圧力が5.4～5.5だったのに、5.2～5.3に減ってました。
移動相はほぼ脱気しないですが、二週間毎に新しい瓶の移動相に変えます。なので、今回は脱気してから検出してみようと思っています。

他に何か注意する点とか経験がありましたら、教えてください。

回答No.1

MIYD

パラベンは流したことがありませんが。
何一つ条件も結果も、検討した条件も書かれていませんが、これで何故原因が他人にわかると考えているのですか？

＞保持時間のズレはどれぐらいまで許容範囲ですか？
HPLCで大事なのは目的を達成することです。
目的を達成することが出来るのであれば、RTのずれの許容範囲はどうでもいいです。
極端な話、同定できれば、各ピークの位置が入れ替わってもいいという場合もありえます。
目的が、毎回0.1minのずれも生じさせずにサンプルを検出するというのであれば‥。頑張ってください。

>同じ溶液でしたら、保持時間も同じだと
同じ溶液であることはどのように検討しているのですか？
グラディエントポンプの精度、カラムや溶液の温度、溶液中の成分の酸化状態、溶液中に含まれるガスの量、溶液のpH、揮発成分の揮発による組成の変化などをどこまでコントロールできているのですか？
また、各パラメーターの誤差の教養範囲は広いのですか？それとも狭いのですか？
同じサンプルを連続して10階程度流して、RTのRSDはどのくらいなのでしょうか？

おそらく、致命的なほどRTのぶれはないか、何処か間違えているかのどちらかだと思いますけどね。

補足

ご返答有難うございました。

検出するサンプルのRTズレが0.5min ぐらいでしたので、心配しましたが、同定さえできれば、許容範囲は考慮しなくても大丈夫ですね。すっきりしました。

同じ溶液に関して：
一ヶ月前に4種類のパラベンを混ぜて標準溶液を調製しました(そして冷蔵庫に保存）。検量線を作成するために、この溶液の各パラベンのRTを検出しようとしているですが、同じ標準溶液なのにRTが0.3～0.8minずれています。（7回検出）
ポンプの圧力は5.2～5.5
溶液温度及び溶液の酸化状態：標準溶液は各パラベンをアセトニトリル系移動相でメスアップして、冷蔵庫に保存しています。
溶液中のガスの量、PH、のコントロールはしていません。

以上は検出条件ですが、何か心当たりがありましたら、教えてください。