Alexa fluorの遠沈について

質問

蛍光抗体初心者です。現在Alexa Fluor 488,546標識二次抗体を使用しています。結果にDebrisのようなものが見えます。某プロトコールでは15,000rpm、20分以上遠沈してその上清を使用、と書いていますが、ボス（アメリカ人）より長く遠心すると抗体まで沈殿すると言われました。どちらが真実でしょうか？もちろん、どちらも実際試してみるつもりですが、どちらの根拠となる論文も見つけられず、困っています。教えてください。

回答No.3

qrl

染色・バイオイメージング実験ハンドブック（羊土社）によると、
「蛍光標識二次抗体液、蛍光試薬などでは、蛍光色素が凝集することがある。遠心器で15000rpm、4℃、5min遠心し、凝集物を取り除いて使用する。蛍光色素のゴミが多いときは、より強く遠心する」
とのことです。たしかに20minはちょっと長い気がしますよね。ちなみに、わたしはあまりそのゴミが気になったことはないので、卓上遠心器で軽く遠心する程度にしています。

お礼

ご回答ありがとうございます。私もまさにその本を見て「長く遠心した方がいいのか」と思ったわけです。しかし、その根拠が見つからず、また、抗体が（ボスの言うように)遠心で沈殿してしまうのかどうか、も知りたかったので、質問させていただきました。
　biotin-streptavidin法で検出していますが、streptavidin conjugated Alexa fluor 488,546を二次抗体として使用しています。この２次抗体は結局1000rpm, 20minで沈殿しないことは確かめられました。まだ15000rpmではためしていません。
　とにかく、皆様に早速ご回答いただいて感激しました。ありがとうございます。

回答No.2

tatoo

何の実験でどのような結果が出て、質問者さんはDebrisのようなものと判断されたのでしょうか？

どこの何のプロトコールだったか忘れましたが、
製品の中の抗体と未反応のAlexa Fluor蛍光色素を実験に持ち込まないように遠心してから使用しろ、
と書いてあるのを見た記憶がありますが、私は遠心して実験したことありません。個人的には関係無いと思っています。

もし、Debrisのようなものを無くしたいと考えて質問されているのなら、遠心するかしないかはあまり関係無いかもしれません。

いずれにしても、もう少し状況を詳しく教えていただければ
力になれるかもしれません。

お礼

お礼のつもりで補足につけてしまいました。すみません。

補足

回答ありがとうございます。私は初めて使い、ボスに「沈殿してしまうかも」と言われ、長く遠心してもよいものかどうか迷っていました。上の方のお礼にも書きましたが、今回は遠心したことが良かったようです。ありがとうございました。

回答No.1

ga111

それはテクニカルな話なので、普通、メーカー以外の資料はない（メーカーの資料ももしかしたらない）と思います。

なんの結果にDebrisがあるのか不明ですが、両方試しましょう。

お礼

早速の回答ありがとうございます。共焦点顕微鏡で蛍光抗体の結果を観察した際に、alexa fluorの塊のようなスポットが見えていたのです。昨日、1000rpm,20min遠心して上清を使用したところ、ほとんどなくなりました。メーカーの資料にも、ほとんど遠心のことは書いておらず、迷っていました。ありがとうございました。