変異体の発現

質問

現在、動物細胞に目的遺伝子を形質転換し、適当な抗生物質でセレクションをした細胞を使って、さまざまなアッセイをすると同時にcell lysateを使ってWestern blottingを行っています。この際、いくつかの変異体においてまったく発現が見られません。
その原因にはどのようなことが考えられるのでしょうか。

回答No.2

tatoo

どのような遺伝子で、どのような変異をいれたのか、
まったくわからないところでは、可能性を考え出したら
ある意味キリがないように思えます。

状況としては、

ある動物細胞に発現ベクターに組み込んだ遺伝子をトランスフェクションし、
ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンとかでセレクションして
stableな細胞のクローンの単離をこころみ中。
セレクションで中に増えてきた細胞のいくつかを単離して
タンパク質が発現しているかどうかウエスタンで確認したところ
wild typeを発現している細胞はいくつか取れたけれど、
mutantを発現している細胞は取れなかった

といったところなのでしょうか？

深く考えずに、ぱっと思いついたことを書かせていただくと、
前提として、ウエスタンはうまくいっている、
使用した抗体は変異体も認識するとして、

薬剤に耐性でセレクションされてきた細胞においても
目的遺伝子のタンパク質が発現が確認できないことは
経験上たくさんあります。私が考える原因としては、
目的タンパク質の発現は実はしているのだけど
発現が弱すぎて確認できないのかなぁと思ったりします。

あくまで上記したように、wild typeは取れていて、
ある変異体では取れないということであるとするならば
１、その変異体タンパク質は細胞にとって毒性がある
（細胞死を誘導したり、細胞分裂を遅くしたりなど）
２、その変異体のたんぱく質は不安定なタンパク質になってしまう

これらの原因で、その遺伝子が導入され細胞は優先的に死んでしまい
すっごく弱くしか発現していない細胞しかとれないとか、
タンパク質抽出中にタンパク質が分解などでなくなっちゃうとか、
あるのかもしれません。
もうすこし状況がわかると考えるネタが増えると思いますが・・・。

お礼

ご回答ありがとうございます。
またお礼が遅くなり申し訳ありませんでした。

自分も発現しないのではなく、発現量が低いのではないかと考えて、セレクションした細胞をもう少し増やした状態でウエスタンを試み中です。
また、安定性の問題も考えてプロテアソーム阻害剤の使用も試み中です。
ありがとうございました。

回答No.1

tomi-chan

タンパク質が得られるものと得られないものとがある、ということでしょうか？　サザンおよびノーザンブロッティングはされていますでしょうか？　DNAのレベルで導入に成功している場合は、co supression、RNAi、などが考えられます。

お礼

ご回答ありがとうございます。
またお礼が遅くなり申し訳ありませんでした。

とりあえずノザンをやってみようかと考えております。

ありがとうございました。