Inverse PCR

質問

inverse PCRでバンドが出ず、スメアー状の断片が出てきてしまうのですが何が原因でしょうか？

回答No.3

geneticist12

＞その付近の断片を切り出してライゲーションテンプレートとし、ライゲーションハイ2でライゲーションし、ライゲーション液をそのままインバースPCRに使いました。

ふつう切り出しは必要ないと思います。よけいなステップはトラブルのもとです。

inverse PCRの場合、ligationは自己環状化が起こりやすく、断片同士の重合が起こりにくい条件にする必要があります。そのために、制限酵素消化したDNAをなるべく低濃度にして（おおざっぱに言って、<1 ug DNAあたり100 uL以上のvolumeで）ligationします。

うまくいっているならいいですが、そうでない場合は、ligation産物はEtOH沈殿するか希釈して、なるべく反応系をPCRに持ち込まないようにすべきです。メーカによって反応液組成が異なりますが、ものによってはPEGや塩などPCRに干渉する成分が入っています。

PCRに加えるDNA量は多すぎないように、ligation産物だから効率がわるかろうと、普段のPCRよりよけいに加えてもスメアが増えるだけです。
このケースも、鋳型DNAの入れすぎ、サイクルが多すぎの可能性も高いです。

あとは、inverse PCRにこだわらずに、Adapter-ligation PCR, Vectorrette PCRと呼ばれる方法にスイッチするとか。inverse PCRよりsureです。

補足

エタチン+エタ洗浄したんですが、同じ結果しか出ませんでした。方法変えようかなぁ、と今考えています。

回答No.2

tunertune

難しいですね。
ligation前のサンプルと後のサンプルを泳動してみて、泳動性の違いからligationの評価を行うしか思いつきません。
ただ、ligationがうまくいっていないというのはレアケースだと思います。ちゃんと末端がくっつく形で切れていて、適当な酵素量で十分な時間反応を行ったのであれば、ligationを疑うのは無駄足かもしれません。
もう一度、始めのステップから確認したほうがいいかもしれません。
また、primerは確実にDNAを増幅するものですか？配列が同じでも伸長しないものがあります、別のサンプルとかで成功しているのでしょうか？
また、制限酵素をかえてみる（切断面をかえる）のも手かもしれません。

何の目的でinverse PCRを使うのか分からないので、どうかわからないですが、未知の遺伝子配列を知りたいのであれば、泳動でフラグメントがとれているわけですから、ベクターにクローニングして調べるのも手１つの手でしょう。

お礼

ありがとうございます。クローニングで見ていきたいと思います。

回答No.1

tunertune

制限酵素で切れていないか、ligationがうまくいってないのではないですか？
鋳型が少なかったりするとちゃんとバンドがでてくれなかったりするので、primerを２セットつくってnestedでやってみるのも手かもしれません。

補足

制限酵素での切断はサザンでの確認で１本になることが確認できていて、さらに、その付近の断片を切り出してライゲーションテンプレートとし、ライゲーションハイ2でライゲーションし、ライゲーション液をそのままインバースPCRに使いました。ligationがうまく行くかの評価はどう行えばよいのでしょうか？

nestedも試しました。