タンパク質の変性剤（尿素）除去確認

質問

いつもお世話になります。
タンパク質リフォールディングについて教えて頂きたい事があって質問させていただきました。
現在大腸菌を用いてタンパクを発現させ、さらに分子ふるいにて目的タンパク（90kDa）を精製しています。このサンプルには、変性剤として6Mの尿素を使用しているのですが、これをリフォールディングし、ほぼ完全に除去していきたいと思っています。
元々のサンプル濃度が低いため、希釈による方法ではなく透析によってリフォールディングを行いたいと考えていますが、この際、サンプル内の尿素除去の確認としてはどの様な方法を取るのが適切でしょうか。また、透析方法のポイントや、その他のリフォールディング方法についても、ご教授頂けたら幸いです。（リフォールディングに関して記載のある関連図書・資料などもありましたらぜひ教えてください。）
当方初心者のため、大変お恥ずかしい質問で申し訳ありませんがどうぞよろしくお願い致します。

回答No.1

kgu-2 · ベストアンサー

>サンプル濃度が低いため
サンプルの液量によります。
　少ないときは、限外ろ過膜の入ったチューブにサンプルをいれ、遠心分離というのに魅力を感じましたが、やったことはありません。
　普通に限外ろ過をして、液量が減れば、緩衝液などを継ぎ足す
　また、ゲルろ過、というのも確実でしょう。
　多いときは、透析くらいしか。透析チューブは、私の時代は糸で縛っていましたが今はプラスチックのものがあるようで。例えば、100mlだと、その10倍くらいの透析液を入れます。平衡になるのにどれくらいか記憶にありませんが、平衡になれば尿素の濃度は1/10になります。回転子を入れてカタカタ回し、朝と帰宅するときに透析液を3度ほど入れ替えていました。これだと1／1000程度になっていることが期待されますが、理論的にはいつまでも微量は残ります。

　私は、学生時代に尿素を分解するウレアーゼの精製をしたことがあります。粗抽出液のウレアーゼを沈殿させるために、アセトンを加えていました。沈殿を溶解したあと、活性の40%は戻っていました。
　変性させたときに、SHがS-Sになっていたりするので、還元剤も添加してください。メルカプトエタノールを使っていましたが、私はNaBH4なども利用しています。

　以上、20年前の経験なので、今はもっと便利な方法があるような気がします。