Uni-ZAP XR vectorについて。

質問

以前にもこちらでIPTG/X-galによるカラーセレクションについて伺ったことがったのですが、再び質問させて頂きます。

現在、タイトルにもありましたUni-ZAP XR vector（STRATAGENE）をライブラリー作製のベクターとして使用しているのですが、カラーセレクションがなぜかうまく行きません。
マニュアルによると、このベクターではβ‐ガラクトシターゼ活性が弱いため、高濃度のIPTG/X-galが必要とのことでしたが、アガーにX-galを混合させると、どうしても沈殿物が出来てしまい、私のやり方が悪いのかうまくプレーティングする事が出来ません…。
どなたか、同じベクターまたはキット（STRATAGENE社のZAP-cDNA kitです）を使用しておられる方がいらっしゃいましたら、その詳しい方法等、お教え頂きたいと思います。
また、それ以外の方でもアドバイス等ありましたらお願い致します。

各試薬使用量（直径9mmの培養シャーレ使用）
　250mg/ml X-gal(in DMF) 50μｌ
　0.5M IPTG(in H2O) 15μｌ
　　　先にインキュベーションしておいたファージ・E.coli溶液にアガー3mlを加えた後、上記２つを別々に添加し、シャーレへプレーティング。なお、このプロトコールはSTRATAGENEのマニュアル通りです。

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

＞インサート確認の件なのですが、やってみるとno insertばかりになってしまいます。（それでいてコロニーはホワイト。）

実際にインサートの確認をおこなってみてno insertばかりということは、ライブラリーとしては使い物にならないということですね。だとしたら、これ以上、青白こだわってもしょうがないのではないかというのが私の意見です。

no insertなのにホワイトというのは、実はno insertではなくて、アダプターなど短い断片が入っているのではないでしょうか。

補足

その可能性はあるかな、とは思ったのですがやはりそうですか…。
ただ、全くblueが出てこない、ということにかなり引っかかりを感じていたので、カラーセレクションの方法も何か違うのかと思い、質問させて頂きました。（質問時にも記載しましたベクターのβ‐ガラクトシターゼ活性が弱いための高濃度IPTG/X-gal添加など、通常と若干異なる点より）
そんなに難しい手法ではないとは思うのですが、こうも無反応（blueが全くない状態）となるとすんなり納得が出来ないのです。
諦めが悪くて申し訳ありません。
ありがとうございました。

回答No.1

geneticist12

lambda ZAPでプラークを青白選択すると言うことですね。

この場合、青白選択は必須ではないと思いますが。できたライブラリーをタイターチェックして、そのうちno insertがどのくらいの割合で含まれるかを調べるためだけですから。

ベクターアームはEcoRI, XhoIの二重消化で、かつ脱リン酸してあります。no insertが出てくる可能性は非常に低いです。青白がうまくいかないとおっしゃいますが、ひょっとするともともと青（no insert）がないだけかもしれません。

no insertの比率が気になるようでしたら、20 プラークくらいサンプリングして、PCRまたはファージDNA精製してインサートの有無と長さを調べてみたらいいでしょう。no insertの割合が一桁以上くらい低くないとスクリーニングに支障があります。20クローンのうちno insertが、あって一個か二個でなければ、良いライブラリーができたとは言えないでしょう。

補足

早速のお答えありがとうございました。
インサート確認の件なのですが、やってみるとno insertばかりになってしまいます。（それでいてコロニーはホワイト。）
ずいぶん前に同じベクターでカラーセレクションをした時にはちゃんと出来ていたのですが…。ちなみにそのときはX-galを指定の濃度で溶液を作製せず、もっと薄い（20mg/ml）溶液にして、その分入れる量を多くしていました。また、IPTGはニトロ膜に浸透させたものを後から重層させる形でやっていました。
今はもう何が悪いのかすらよくわからなくなってしまいました。どうぞよろしくお願い致します。