- ベストアンサー
in situ probeの疑問について
geneticist12の回答
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
ゲノム上の遺伝子は二本鎖DNAですが、そこから転写されるRNAは二本鎖DNAのうちの一方だけ（antisense strand）を鋳型にします。 転写産物であるRNAはsense strand（つまりmRNAの場合は、ORFをもつ鎖、遺伝子産物であるタンパク質を指定するコドンを持つ鎖）、それと相補な配列をもつ鎖がantisense strandです。RNAがsenseならそれにハイブリするのはantisenseであるのは、当たり前ですね。
関連するQ&A
- in situ のプローブについて
antisense probeと sense probeはどのように区別されるのでしょうか？ 例えば、T7プロモーターの下流に遺伝子配列が組み込まれている場合、T7 RNA polymeraseでは、どちらのプローブが合成されるのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- in situ probeの作り方
in situ 用のRNA probe作製についての質問です。 現在行っているprobe作製の手順ですが、 (1)SP6およびT7の配列を組み込んだPCR primerを使って、目的の配列とpolymeraseの配列を含んだPCR産物を得ます。 (2)このPCR産物をin vitro transcriptionのtempleteとして用い、RNAを合成します。 (3)RNA columnにより精製し、最後にgel上でバンドの確認をします。 この最後のgel上での確認の際、バンドが2本見えます。1本は目的のサイズです。スメアではないのでRNAが分解したものではないと思います。 DNAのコンタミかと考え、in vitro transcriptionの試薬を新しくし、再試行しましたが、同じ結果となりました。 どのようにしたらこの問題を解消できるのでしょうか。 in vitro transcriptionの前にgel extractionによりPCR産物は精製しているので、全く異なる配列のRNA産物ではないと思うのですが、このままin situに使えますか？ もし、シグナルが得られても結果に自信が持てない気もしますが。。 よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- 今、ホールマウントin situハイブリダイゼーション でウニの遺伝子
今、ホールマウントin situハイブリダイゼーション でウニの遺伝子の染色やってるのですが RNAプローブを胚に加えて一週間ほどインキュベートした後、MOPS バッファーで何度も洗うのはなぜですか？ それから加えるRNAプローブの濃度が0.1ng/mlだったのですが、もし加えるRNAプローブの濃度を高くしたら（100ng/ul)何が起こるのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- in situに用いる固定液について
現在in situ hybridizationを行なおうと思い、色々本を読んでますが、固定液について質問です。 成書には、とにかくRNaseフリーにするために、DEPC処理とか、乾熱滅菌とか色々書いてありますが、経験者によると、実際はそれ程気にしておらず、特にRNaseについて気にしてないようでした。 では組織が持つ内因性のRNaseはどう気をつけてるの？と聞いたら、アルデヒドで固定する為に、気にしないレベルになっていると思う、との答えでした。 さて前置きが長くなりましたが質問です。 普通in situの固定にはホルムアルデヒド固定を行い、架橋結合により併せて酵素も失活出来ると思いますが、アルコール固定のみによる変性固定では、RNaseの失活は期待できないでしょうか？ 質問の意図としては、ホルムアルデヒドを作るのが面倒なのと、架橋によるプローブの浸透が阻害されるような気がするので、アルデヒド固定を省くことが出来れば、いろいろ良いことがあるんじゃないかと思ったのです。 面倒ですが、どなたか示唆を頂ければありがたいです。
- ベストアンサー
- 生物学
- DNAプローブの作製法
FISHに使用するDNAプローブを作製するとき、DNAサンプルのインサートはベクターから切り離した方が良いのでしょうか？インサートは2kbpほどです。また、インサートを切り離す場合、制限酵素で切断した後どのような作業をすればよいのでしょうか？または制限酵素で切断してすぐにラベリングしても大丈夫なのでしょうか？本を見ても書いてないので困っています。
- 締切済み
- 生物学
- ライゲーションの配列特異性について
ライゲーションにおける配列の特異性についてです。 ＤＮＡセンス鎖に連続的にハイブリダイズする２つのアンチセンスプローブをハイブリダイズさせ，ライゲーションし２つのプローブを結合させることを考えています。 この場合，ライゲーションサイト以外の配列の特異性はライゲーションの効率にどの程度影響を及ぼすのでしょうか？ また，それに関連して最低どの程度の長さのプローブをこの目的のためには用いるべきでしょうか？ 何か参考になる文献，論文などが有りましたら併せて教えて頂けると助かります。
- ベストアンサー
- 生物学
- in situ ハイブリダイゼーションのプローブ
よろしくお願いします。 現在私はマウスの子宮を用いてin situ hybridizationを行っているのですが、自分の手技に問題がないか確認するために、ポジコン用のプローブを探しています。 しかしながら論文検索した限りでは、適当なプローブが見つかりませんでした（写真が不鮮明、条件の記載が不十分等）。 そこでお聞きしたいのですが、上記の様な配列および条件が記載してある論文やＨＰを、どなたかご存知ないでしょうか。 なお手技の確認が目的のため、特に子宮特異的なプローブではなく、例えば筋層特異的とか、上皮特異的なもの等、他の組織と区別が可能なものであれば構わないかと思います。 以上ご面倒ですが、どうかよろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
- ＲＮＡポリメラーゼは、どうやって出来るんでしょうか？？
ＲＮＡポリメラーゼは、５０万ドルトンもの 巨大な質量を持ち、かつ、高機能多機能蛋白質酵素 だそうですが、このＲＮＡポリメラーゼがないと ｍＲＮＡが合成できないそうです。 そこで、ご質問ですが、 このｍＲＮＡを造るＲＮＡポリメラーゼ(2)という 蛋白質は、どうやって出来たんでしょうか？ ＤＮＡのプロモータを探しだして、開始位置を確認し 転写開始をon・offする大事な役目も担っている そうですが・・・ このような「重要な蛋白質酵素」が、ＤＮＡが地球上に 最初に出現したとき、たまたま、その側に存在していたの でしょうか？？運良く・・・ なんとも不思議な気がするんですが・・・ どなたか、よろしくアドバイスのほどお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
- mRNAのシークエンスについて
私は哺乳類のある酵素のmRNAの配列を決定する実験をしています。 他種間で相同性の高いプライマーを使って一部の配列を読み、あとはRACE法で全長を読む予定です。 お聞きしたいのはそれぞれの断片を読む時のシークエンスの方法なのですが、私はダイレクトシークエンスで全部配列を読もうと思っているのですが、これは一度プラスミドに入れてから読むべきなのでしょうか。 読んだ論文ではプラスミドに入れて配列をよんでいるものがほとんどのように見受けられ、不安なのですが… ちなみに実験の目的はin situのためのプローブづくりなので、 全長を読んだ後適当な大きさの断片をプラスミドに入れてプローブを作ろうと思っています。 遺伝子については初心者なので、的外れなことを書いているかもしれませんが、お教えいただければ幸いです。 よろしくお願いします。
- 締切済み
- 生物学
補足
早速のご回答、どうもありがとうございます。 私の理解が悪くて申し訳ないのですが、 DNAから転写されるRNAは2本鎖DNAの一方だけですが、2本鎖のどちらを選んで転写しているのでしょうか？(なんか決まった法則とかあるのでしょうか？) DNAから転写されたRNAに相補的な配列のprobeがハイブリダイズされますが、それは5'-----AAAA3'のRNAがあったとしてそれに相補的なanti sense probeは3'------5'ということですよね？ でも5'------3'で合成しても、ひっくり返せば3'-----5'となるわけでハイブリダイズされるのでは…？と考えてしまいます。 理解が悪くて申し訳ないです。よろしくお願いします。