- ベストアンサー
今、ホールマウントin situハイブリダイゼーション でウニの遺伝子
- みんなの回答 （1）
- 専門家の回答
質問者が選んだベストアンサー
>MOPSバッファーで何度も洗うのはなぜですか？ 原理的にはRNAプローブは相補的なmRNAに結合するのですが、 そもそも発現しているmRNAに比べて0.1ng/mlという濃度は「超」多すぎる、過剰量のRNAです。 なので、目的のRNA以外の何かしらに引っ付いていたり、引っかかっていたります。 それらを洗い流す必要があるからです。 目が小さいスポンジをRNA溶液中に浸して洗わずに次の工程に進むか、 しばらく何かの液に浸して洗ってから次の工程に進むか、 これを想像すると、何となくわかると思います。 ＞もし加えるRNAプローブの濃度を高くしたら（100ng/ul)何が起こるのでしょうか？ 先にも述べましたが、0.1ng/mlという濃度は「超」多すぎる、過剰量のRNAです。 なので、それ以上というと、さらに目的のRNA以外に引っ付いたり、引っかかったりする確立が高まります。 あと、必要以上のものを使うと、経済的にも厳しいです。
関連するQ&A
- 外来遺伝子のin situ ハイブリダイゼーション
外来の遺伝子の発現を調べるのに、遺伝子につけたＨＡやＦＬＡＧなどのタグを含むプローブというのは使えますか？ 内在の遺伝子と区別したい場合、普通は配列の違う別の種の遺伝子を使って、in situ ハイブリダイゼーションをするのでしょうか？
- ベストアンサー
- 生物学
- 今さら周りの人に聞けないin situ probeの疑問
マウス胚でwhole mount in situをやっているのですが、probe合成でいつも疑問に思っていることがあります。それは、ハイブリダイズさせるためにanti sense probeを合成するのですが、なぜsense probeだとRNAにハイブリダイズされないのか？です。 anti sense probeをプラスミドから合成する時は、必ずインサートの5'側を制限酵素処理してリニアライズし、インサートの3'側からSP6とかT3 T7などの酵素でprobeを合成します。 でも逆にインサートの3'側を制限酵素処理してリニアライズ，インサートの5'側から合成したってハイブリダイズするんじゃないかと思ってしまいます。RNAは1本鎖だから。でも実際はそうではありません。 RNAに実際にどのようにprobeが反応するのかイマイチ分かりません。 手元にある本とかネットでも調べましたがありませんでした。 in situを始めて2年になって今さら、周りの人に聞けなくて。どうぞよろしくお願い致します。
- ベストアンサー
- 生物学
- 遺伝子の染色体上の有無を調べる方法
バイオインフォマティクスではない実験でヒトのある遺伝子が性染色体上(X、Y)にあるかどうかを実験的に調べる方法を教えてください。 in situ hybridizationを用いた方法は知っているので それ以外にあったら教えてください。
- 締切済み
- 生物学
- Whole mount In situ ハイブリダイゼーションについて
Whole mount in situ ハイブリダイゼーションとはどのような手法ですか？方法や原理など分かる方教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- 植物の in situ ハイブリダイゼーション
実験で植物のin situ hybridizationを試みています。 しかし、なかなかうまくいかず、発色が確認できません。 経験者の方で、「ここは気をつけろ」みたいな注意点やアドバイスがあれば、 お聞きしたいのですが、よろしくお願いします。 材料はタバコで、標識にはDIGを用いています。
- ベストアンサー
- 生物学
- 染色体の研究で FISHとBACの違い
非生物分野の者です。生物学の基礎知識は高校生くらいなのですが、ふだん研究者の会話が身近にあります。 染色体の検査で、FISHとBACの違いがよくわかりません。 Fluorescent in situ hybridization,bacterial artificial chromosome で、どちらも染色体の特定の場所とだけ結合するものと理解しています。。 生物の研究者の会話で、FISHではどうだとか、BACではどうだとかという会話を聞きます。自分のイメージでは、ゲノムの特定の場所とだけハイブリダイズするプローブと言う点で、同じものと始めは理解していました。でもどうも違うようです。FISHで欠失を証明する、とか、BACを並べてとかいう言葉、これを逆にしたら言葉になりませんか。 どなたか、やさしく教えていただけないでしょうか。わかりやすいホームページがあったらそれも教えてください。
- ベストアンサー
- 生物学
- in situ ハイブリダイゼーションのプローブ
よろしくお願いします。 現在私はマウスの子宮を用いてin situ hybridizationを行っているのですが、自分の手技に問題がないか確認するために、ポジコン用のプローブを探しています。 しかしながら論文検索した限りでは、適当なプローブが見つかりませんでした（写真が不鮮明、条件の記載が不十分等）。 そこでお聞きしたいのですが、上記の様な配列および条件が記載してある論文やＨＰを、どなたかご存知ないでしょうか。 なお手技の確認が目的のため、特に子宮特異的なプローブではなく、例えば筋層特異的とか、上皮特異的なもの等、他の組織と区別が可能なものであれば構わないかと思います。 以上ご面倒ですが、どうかよろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
- 現在マウスの胚盤胞からtotal RNAの精製→定量実験を行っています
現在マウスの胚盤胞からtotal RNAの精製→定量実験を行っています。 最終的にはマイクロアレイにかける予定です。 （数十個～100個近く集めるので、例えばsingle-cellを増幅するような特別な方法はとりません。） その定量が、今うまくいっておりません。 blastocyst 1個＝2 ngだそうなので、30個＝60 ngとして精製していますが、 微量専用の電気泳動で定量すると、数ngと出てしまいます。 brain total RNA60ngをcontolとして同様の処理を行うと、そちらは多少のロスがあるものの、 リーズナブルな量が定量できます。胚になるとどうもダメなようです。 リアルタイムPCRしても、やはり狙ったサイクル数より多くなってしまいました。 マウス胚は、IVFした後胚盤胞まで培養し、少量の培養液と共にエッペンチューブに移し、 すぐにTrizol 200ulを足してよくピペッティング→-80℃保存、という形で回収しています。 いつも培地からそのままエッペンに移しているので、 回収時にmineral oilが含まれているとダメかと思い、brainのサンプルをwith oilバージョンで 試したのですが、non-oil バージョンと収率は変わりませんでした。 哺乳類の胚あるいは卵からtotal RNAを精製し、定量したことのある方、 ご存知のことがあれば教えて頂ければと思います。 よろしくお願い致します。
- 締切済み
- 生物学
- in situ hybridizationのFISHはなぜDNA?
分子生物学の初心者です。 ISHこれからやろうと思っているのですが、なぜFISHはDNA推奨なのでしょうか？ またFISHでもRNAで行うことは可能なのでしょうか？ よろしくお願いします。
- ベストアンサー
- 生物学
お礼
早速回答していただきありがとうございました。 大変解りやすく助かりました。 もうひとつお伺いしたいのですが、そもそもMOPSバッファーで洗い流すとき、MOPSバッファーはどのように作用するのでしょうか？ MOPSバッファーでなければいけない理由はあるのでしょうか？