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ＤＮＡの濃度を上げる方法
私はDNAの大量培養をする際にキアゲンのHispeed plasmid midi kitを使用しています。その際に得られるDNAの濃度がいつも薄くて困っています。トラブルシューテイングなどを読みましたがよくわかりません。濃度が濃かったらTEを入れて調製するということを先輩から聞きましたが、濃かった場合は使いたい濃度になるように計算してその量をいれるいうことでした。なにか濃度を上げる簡単な方法（入れる溶液など）があれば教えていただきたいと思っています。よろしくお願いします。
- water-green
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midiでとられているのでしたらDNAが十分あるでしょうからエタノール沈殿を再度行うのがいいと思います。カラムからの持ち込みや滅菌操作の意味のかねて必ずエタノール沈殿で濃縮を行うヒトもいるぐらいです。 なお、エタノール沈殿前には酢酸ナトリウムなどの塩を入れることをお忘れなく。 plasmid溶液（溶出したもの）1 100% エタノール ３ 3M 酢酸ナトリウム 0.1
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- tomoyaok
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培養物を処理した後にカラムにロードしますが、 その時に所定量の３倍くらいをロードしましょう。 単純にロードの操作を３回するだけです。 つまりカラムに対してかなりオーバーロードになっているはずです。 後の操作は同じにすれば、キットに期待できるくらいの濃い液が とれているはずです。 それでも薄ければ、途中の操作が悪いのでしょう。 一度先輩に横についてもらって実験を指導してもらってはいかがでしょうか。
やはり濃度を上げるには、培養の段階から検討した方がいいと思います。 Hispeedは使ったことがありませんが、始めに３ｍｌ程度の培地で６，７時間培養し、その後１００ｍｌの培地にその培養液１００μｌを入れて、そこから１４時間程度培養します。この過程がまず収量をあげる大事なステップです。 次に大切なのは遠心後の菌のペレットの懸濁です。自分は１０ｍｌピペットで懸濁した後、だめ押しで１ｍｌのマイクロピペッターでさらにピペッティングします。目視では分からない菌の塊が先の細いチップにより完全に懸濁されるわけです。 最後にイソプロ沈殿のあとの７０％エタノールでの洗いをしっかりやることです。これをおろそかにするとDNAの溶解度が極めて低下して、結局は収量の低下を招きます。 以上３点を守ることで、自分の場合はlow copyのプラスミドでも随分収量が上がりました。
- ebikichi
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>トラブルシューテイングなどを読みましたがよくわかりません。 ということは、量が思ったより取れていないということでしょうか。 kitは簡単で便利ですが、原理を熟知してないと、思わぬところで苦労することがあります。 培養液量を増やす、最後の溶出液で溶出を繰り返すなどの手もあるかと思いますが（Hispeed plasmid midi kitは使ったことが無いのでわかりませんが）、シリンジを押す力などちょっとしたコツがあると思います。何回も使用経験のある方（あるいはキアゲンのテクニカルサポート）にお聞きになるのがよいと思います。 単に濃度を上げたいならエタ沈ですが、このkitは最後にエタ沈（イソプロですが）しますね。イソプロ入れた後、遠心してみては？ DNAの沈殿がでるはずです。 注）Hispeed plasmid midi kitは使ったことが無いのでご参考まで
お礼
確かに少し最初の頃は押しすぎたりしていたこともあり、なかなかうまく行かないことが多々ありました。そのため、もう一度しっかり説明書を読んで確認し一定の圧力でシリンジを押すように心がけています。ここで質問したかったのは、濃度を上げることだったのでebikichiさんのおっしゃるようにイソプロを入れた後に遠心してみることにします。ありがとうございました。
- sue_3
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濃度を上げるとは、収量ををあげるという意味ですか？単に濃い濃度の溶液が欲しいということでしょうか。 濃度を上げたい場合はエタ沈などで濃縮します。もちろん先輩の言うようにペレットを溶かすTEの量を少なくすれば濃くなりますよ。
お礼
説明不足ですみません。この場合は濃度をあげるということです。収量に関しては十分な量なのでどうしたら濃度を上げることができるかということをお聞きしたかったのです。ありがとうございました。
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