制限酵素サイトが目的遺伝子内に存在していた…
EcoR1の制限酵素サイトを含むプライマーと他のの制限酵素サイトを含むプライマーを設計して、目的の遺伝子(約2000bp)をPCRで増幅させました。
しかし、いざEcoR1でのファストダイジェストをしアガロース電気泳動をすると、目的の位置ではなく約1000bpのところにバンドが現れました。
遺伝子のデータベースで確認したところ、目的遺伝子の配列中にEcoR1サイトと全く同じ塩基配列があることに気付きました。
泳動結果と照合して、おそらくその位置でEcoR1により切断されたのだと思われます。
私の不確認が原因だとわかっていて、すごく後悔しています。
この場合、EcoR1のサイトを含まないプライマーを設計しなおすのが妥当であると考えられますが、
もしも、なんとかこのEcoR1の制限酵素サイトを含むプライマーを用いてPCRをした断片を目的の位置で制限酵素処理できる方法がもしもありましたら、教えていただけませんか。
どなたか打開策をご存じな方がいらっしゃいましたら、わかりやすく教えてください。
また、このことを相談したところ「EcoR1(NEB社)がAのオーバーハングしているか、Aの付加反応があるか」を調べてみることになりました。
この件を調べることで、何か改善できる点があるのか、自分なりに調べましたが答えが見つかりません。
恥ずかしながら知識不足のゆえ、わかりやすく解説していただけ方がいらっしゃると幸いです。
また、その調べ方だけでもご存知の方がいらっしゃいましたら、自分の勉強のためになりますので調べ方(本等でもかまいません)を紹介していただけませんか?
長文になりましたが、ぜひともよろしくお願いいたします。