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overnight 制限酵素処理
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>ベクターにインサートを入れるとき、インサート末端を制限酵素で切ることがありますよね？その際、切れにくい配列があると思うんですが、そのときどうすべきか迷っていたのです。 制限酵素のユニット数は基本的にラムダファージDNAなどのlinear DNAの消化能で定義しますが、super coiledのプラスミドは制限酵素消化に抵抗性があるので、linear DNAより多くの酵素量が必要です。 何倍くらい必要かというのは酵素ごとに違いますが、その情報もカタログ（例えばTAKARAの）に出ています。たとえばSalIだと30倍（1ug プラスミドに30 units）だとか。 そういう酵素はやはり、時間を延長してどうにかしようというより（理由はこの前に書き込んだとおり）、量をふやして1時間ないし数時間で反応を完了させるのがいいです。
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- geneticist12
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根本的なことですが、なんでオーバーナイトでするのかな？ 酵素を10倍量もいれれば短時間で（計算上は6分、30分あれば完了でしょう）。 オーバーナイトの反応は特別な理由（そうしなければ完全消化しない酵素の場合など）がなければするべきではありません。なぜなら、 ・試薬がクリーンでも、用意したDNAが完全にヌクレアーゼフリーとは限らないので、長時間の反応で分解が進む可能性がある。 ・酵素をけちって長時間反応で切ろうとしても、酵素が失活してくるので思ったような効果がえられるとは限らない。 反応がオーバーナイトになるような実験スケジュールしないようにするのもスキルのうちです。
補足
ベクターにインサートを入れるとき、インサート末端を制限酵素で切ることがありますよね？その際、切れにくい配列があると思うんですが、そのときどうすべきか迷っていたのです。もちろん、スケジュールの都合で..ってケースもあるんですが..。 ＞反応がオーバーナイトになるような実験スケジュールしないようにするのもスキルのうちです。 ごもっともです...。
- geneticist12
- ベストアンサー率67% (701/1045)
>具体的にはどんなことがおきるのでしょうか？単に本来切れないところが切れるとかそういう現象なんでしょうか？ スター活性といって、正確な認識配列でないところが切れてきます。 Fermentasのカタログにはスター活性（EcoRI、酵素量40倍、16時間、70時間）が起こったときの泳動像が出ています。結局、消化物を電気泳動して変なパターンになっていなければ、過剰な条件の反応をしても問題ないです。 単純にいうと、1 ugの線形DNAを1時間で完全消化する酵素量1 unitですから、酵素量を10倍の10 unitsにすれば10倍過剰、時間を10倍の10時間にしても10倍過剰、両方とも10倍にすれば、10x10で100倍過剰と考えます（ただし、経時的失活が酵素ごとに異なり一概には言えないけれど、最大値として）。 一方、メーカーごとに、酵素の品質管理として、20倍、50倍、100倍など過剰な消化をおこない、電気泳動で分析してヌクレアーゼのコンタミになどによる異常な切断・分解がないことの試験や、ligation、recutting試験をしたりしています（カタログやデータシートにのっています）。目安として、テストに使われている程度の過剰消化であれば安全圏と考えていいです。メーカーがやっている条件はかなり余裕を持たせているようで、実際はそれより何倍かの過剰消化でも大丈夫です。酵素量10倍、オーバーナイト反応だと160倍くらい過剰ということになると思いますが、経験上たいていの酵素はそれくらい平気だと思います。 ただし、酵素ごとにスター活性の出やすさや寿命が違うので（これらもカタログに資料がある）どれくらいの過剰まで大丈夫かは一般化できません。スター活性が出やすかったり寿命が長い酵素は、酵素や反応時間が極端に過剰にならないように配慮した方がいいでしょう。
お礼
いろいろと参考になる情報ありがとうございます。
- otx
- ベストアンサー率44% (256/576)
いえ、元々多量に入れています。ユニットなんか関係無く、単純に反応液料の1/10量の制限酵素を加えたりとか。
お礼
そうなんですか..。参考にさせていただきます。
- otx
- ベストアンサー率44% (256/576)
そもそも私は減らしませんけど・・・。 制限酵素のことはこんなところで質問されなくても 各メーカーのカタログを見れば、これでもかっていろいろなデータが載っていると思います。
補足
あ、減らさないんですか？そういう人もいるんですかね？じゃあ 大丈夫なんでしょうか。。とういうか、そもそも数時間の反応でもたくさん（ex.プラスミド1ugに10u）入れてなかったりします？1ugに対し1uとか
- MIYD
- ベストアンサー率44% (405/905)
何が混入しているか分からない酵素が何を起こすかは誰にも分かりません。 スター活性という用語を調べると参考になると思います。
補足
うーん、スター活性のとこでは1ugに100u以上でスター活性が出るという記載はありますが、overnightのことは特に何も書いてませんね。。。
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お礼
なるほど。。よくわかりました。ありがとうございます。