制限酵素の謎とは？
- 制限酵素を用いたDNA切断実験でのスター活性の観察結果について調査しました。
- 実験結果から、制限酵素の種類と反応時間がスター活性に影響を与える可能性があることが示唆されました。
- 加えて、グリセロール濃度がスター活性の発生を促す要因となる可能性も考えられます。
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制限酵素の謎
(1)ある実験において、2種類の制限酵素を用いてあるDNAを切断しました（AとBとします）。16時間とかなり長く反応時間を与えたため、DNAバンドはゲルの下方に確認され、『これはスター活性が起きた』と判断しました。 (2)後日。 スター活性を恐れた自分は反応時間を10時間以内に抑え、同条件でもう一度制限酵素処理を試みました。結果、前回よりもゲル上方にバンドが確認でき、完全ではないが『スター活性はある程度改善された』と判断しました。 (3)そして昨日。 制限酵素A抜きに、BだけでDNAを切断する反応を時間別に行ないました(1h,3h,6h,9h,16h)。これは『制限酵素Bがスター活性を起し始める』と考えられる反応時間を明らかにするため行ないました。結果、長時間反応させたにも関わらず、どの反応時間でも問題なく切断が行なわれていました。 以上の実験より、自分はこの様に考えています。 ・(1)(2)において。２種類の制限酵素を用いたため、グリセロール濃度が上昇した。よってスター活性が起こり易く、反応時間別の影響が大きい。 素人考えですが、自分なりの解釈です。その他に考えられる理由や経験をお持ちの方、ぜひお聞かせください。m(__)M
- allhoprisg
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反応時間過剰や酵素量過剰（数十倍程度）では、よっぽどのことがなければスター活性は起きません。グリセロール濃度も5%以下なら大丈夫だと言われていますが、10%くらいまでなら経験上問題ないです。 PstIとBstYIでは至適塩濃度(至適温度も）が違いますが、同時に切るときバッファーは何を使ったのでしょう。予想ですが、BstYIに合わせてMかなにかにしたのではないでしょうか。PstIはHなので至適塩濃度より低くなりますね。このように、至適塩濃度より低い塩濃度で制限酵素を使うとスター活性が出やすくなります。 各メーカーが、至適塩濃度がことなる二重消化のときの推奨バッファーのテーブルを出していたりしますが、信用しない方がいいです。その一方で各メーカー（あるいは教科書）はバッファーが違うと切れなかったり、スター活性がでるとさんざん注意しているはずです。二重消化ならそれが起こらないという理由はないです。 それぞれの至適バッファーで順番に切るのが基本です。BstYIをMで効かせてから、Hになるように塩を加えてPstIで切るのが簡単でしょう。
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- dolphino
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どちらも大してスター活性が出ない酵素だとおもうのですが、コンタミでは？この場合、AのPstIに何かが混ざっていた（同僚が原因の不幸）。 酵素を二つ入れることによるグリセロールの入れすぎを気にするとしても、どれだけ入ったか分かっているはずですよね。No2の回答のように10％ぐらいまでは気にならない場合がほとんどだと思います。 もしくは当時は経験不足だった、ということなので、ピペットマンで１マイクロリットルとったつもりでチップの外側にべったり、３マイクロぐらい取ってしまって大量のグリセロールが入っていたとか。
お礼
＞＞もしくは当時は経験不足だった、ということなので、ピペットマンで１マイクロリットルとったつもりでチップの外側にべったり、３マイクロぐらい取ってしまって大量のグリセロールが入っていたとか。 ガチですね(汗。コレは否定しにくいです。練習しますσ(^_^;) 遅ればせながら、回答ありがとうございました！
- owata-www
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そのＡ、Ｂがなんなのかわからないのでなんとも言えませんが… ・(1)で制限酵素Ａがスター活性を有していた ・制限酵素の至適pHがそれぞれ違う ・Ａ、Ｂに必要な金属イオンの違い … ぐらいじゃないですかね？てか、そもそも16時間も初めにやるんですか？ビックリなんですけど…
お礼
早速の回答を頂き、感謝です。 AはPstIで、BはBstYIです。 ＞＞そもそも16時間も初めにやるんですか？ビックリなんですけど… これに関しては、明らか当時の自分の実験経験不足です。２～３時間で切れることは直ぐ分かったので…。 ＞＞・(1)で制限酵素Ａがスター活性を有していた ・制限酵素の至適pHがそれぞれ違う ・Ａ、Ｂに必要な金属イオンの違い ありがとうございます、制限酵素の会社の取説をよく読んでみようと思います。
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