２つの制限酵素を使った制限酵素処理が成功しません。

質問

制限酵素処理後にアガロースゲル電気泳動を行ったのですが、目的の断片が確認できません。

○反応溶液（DNA 5ug/H Buffer 1ug/BSA 1ug/BstEII 0.5ug/mili Q 2.5ug）
→60℃ overnight(20h)Incubate
→反応溶液にBstX I 0.5ugを加える
→37℃ overnight(20h)Incubate
→Loading Bufferを加えてアガロースゲルで電気泳動

はじめは以上の概要でIncubateする時間を20hではなく1hで行いましたが、目的断片を確認できませんでした。

そこで反応時間を20hにしたのですが、上手くいきませんでした。

疑問があるのですが、

(1)はじめに混合する試薬の量を間違えているのでしょうか？
(2)制限酵素を加える度にBufferを加えるのでしょうか？

また何か実験が成功しない理由として、お気づきの点があれば教えていただけると幸いです。

よろしくお願いします。

回答No.2

warudori

・「うまくいかない」という状況をもう少し補足してください。非特異的に切断されるのか、まったく切断されないのか、もしくは分子量が上がったように検出されるのか。

・制限酵素が失活している可能性を排除するためにはポジティブコントロールがあることが望ましいです。
メーカーからポジティブコントロールを分けてもらえることがあります。
メーカーに相談してみてください。

ちなみに、この泳動用DYEはSDS含有のものでしょうか。
反応後液を精製しないのでしたら制限酵素が泳動の妨げになることがあります。SDS入りのDYEが望ましいです。
（制限酵素に添付されているか、ニッポンジーン社などから売ってます）

お礼

ありがとうございます！

全く切断されていないです。

反応時間を長めにしすぎて、失敗するということはあるのでしょうか？

回答No.1

rakudasax

(1)はじめに混合する試薬の量を間違えているのでしょうか？
BstEIIの添付bufferで反応していますか？
Hと表記されているので、Takaraですかね？
Takaraのカタログにはなかったような。
BstEIIがTakaraで販売されていない酵素だとしたら、そもそも使用するBufferが違うという事はないですかね？

(2)制限酵素を加える度にBufferを加えるのでしょうか？
加える必要はないです。

一応、トラブルシューティングの基本として、何の手順が原因なのかをはっきりさせる事をお勧めします。
二回切ってから、流して確認しているんですよね？なら、一度切ったら流して、その時点で切れているのかを確認した方がいい思います。
また、違うとは思いますが、10μの系で行っているなら、そこに0.5μを添加することで至適反応条件ではなくなる可能性もゼロとは言えないと思います。

参考程度に。

お礼

ありがとうございます！

メーカーを確認してみます！