• ベストアンサー

サンプルバッファー

以前たんぱく質の実験をしたときに、SDS-PAGEを行う前にたんぱく質にサンプルバッファーを加えました。その後、サンプルバッファーで処理したたんぱく質を100℃で処理するのはなぜなのでしょうか?

  • 化学
  • 回答数2
  • ありがとう数3

質問者が選んだベストアンサー

  • ベストアンサー
  • gori8063
  • ベストアンサー率36% (116/319)
回答No.1

サンプルBufferには恐らく、色素(泳動のトレース用)、糖類(比重を上げるため)、還元剤(メルカプトエタノールかジチオスレイトールなど)、SDSが入っているはずです。 加熱することによりタンパク質を変性させて構造を壊してやり、SDSが全体に付着する、還元剤が全てのS-S結合に行き渡って還元が完全に行われるという効果があります。

tiktak010
質問者

お礼

回答ありがとうございました!! 納得しました。

その他の回答 (1)

  • dadachan
  • ベストアンサー率50% (195/386)
回答No.2

参考までに、別にboilする必要があるわけではありませんよ。 私は室温放置数時間でやってました。 boilによって、サンプルバッファー中に溶解しているものが析出する事があったりしたので。 でも、そのような特殊な場合でない限りは、boil5分が手っ取り早いでしょうね。 しっかりと蛋白質とSDSを1:4の割合で結合させて、分子量を正しく出すためですからね。

tiktak010
質問者

お礼

回答ありがとうございました。 boilする必要が必ずしもあるとは限らないとは知りませんでした…

関連するQ&A

  • 電気泳動とサンプルバッファーについて

    電気泳動のことでお願いします。電気泳動装置には電圧表示が出て、電気が通っているようですが、実際、装置の中を見たら、小さな泡が出ておらず、通電していないようですが、これは、バッファーがまずいのでしょうか? SDS-PAGE用のSDSラニングバッファーは、トリス、グリシン、SDSと規定の量を入れてメスアップしているのですが、何か原因はあるでしょうか? また、ミオシンタンパクを抽出して、タンパク濃度を測定し、SDSサンプルバッファーで希釈するのに、その方法ですが、ウェルに10マイクログラムのタンパクが入るように計算して、それぞれのサンプルの希釈度を決定して作るのと、ある一定の希釈に決めて、ウェルに投入するときに10マイクログラムになるように、投入量を5マイクロリットルとか8マイクロとかにするのとどちらの方がいいとか、決まった方法はあるのでしょうか。よろしくお願いします。

  • SDSサンプルバッファーを使ってのタンパクサンプルの作成

    ミオシンタンパクを抽出して、タンパク濃度を測定し、SDSサンプルバッファーで希釈する時のその方法ですが、ウェルに10マイクログラムのタンパクが入るように計算して、それぞれのサンプルにあった希釈度を決定してサンプルバッファーを入れて作る方法と、(SDSの濃度が各サンプルごとで変わるからダメかな?)ある一定の希釈に決めて、ウェルに投入するときに10マイクログラムになるように、投入量を5マイクロリットルとか8マイクロとかにするのとどちらの方がいいとか、決まった方法はあるのでしょうか。よろしくお願いします。

  • タンパク作成時のSDSサンプルバッファーでの希釈率について

    SDS-PAGEでタンパク分離を行う際にサンプルを作るるとき、SDSサンプルバッファーで希釈する倍率のことですが、先行研究では、抽出液をバッファーで何十倍に希釈するなどとありますが、タンパク濃度を測って、ウェルに10μgタンパクが入るように計算して希釈する方法と、どちらが正しいとか間違っているとかあるのですか。ミオシンのバンドを出しているのですが、筋肉のほとんどはミオシンで量が多いので、濃度を測らずに何十倍などというアバウトな希釈でいいということですか?実際、結構きれいなバンドが出ましたが・・・濃度を測って10μgのタンパクを入れるようにと思い計算してすると、他のタンパクのバンドもたくさん検出され、ミオシンのバンドが分離していないか、ぼやけてわかりにくいのです。 希釈の方法により、実験結果の信憑性など何か問題になる部分があるのでしょうか。よろしくお願いいたします。

  • TFAで溶出したサンプルを電気泳動したい

    2%TFAで溶出してきたサンプルをSDS-PAGEで流したいのですが、サンプルバッファーを入れると通常のサンプルは青色のままなのですが、赤っぽくなってしまいます。このまま泳動しても問題ないものなのでしょうか?そもそもSDS-PAGEのサンプルの条件として至適pHなどはあるものなのでしょうか? 知識不足で申し訳ありませんが御教授願えれば幸いです。 宜しくお願い致します。

  • サンプルバッファーで溶解したタンパク質の濃度測定

    タンパク質を1×サンプルバッファーで溶解したものを、濃度測定(ブラッドフォード法)することは可能でしょうか? 着色していないサンプルバッファーで溶解したものなら測定できるかな・・・?と思ったのですが。

  • SDS-PAGEの泳動バッファーは滅菌必要?

    SDS-PAGEの泳動バッファーは滅菌必要? SDS-PAGE用の10x泳動バッファー(Tris/Glycine)は 滅菌(オートクレーブ or フィルター)必要ですか? よろしくお願いいたします.

  • ウエスタンブロットで・・

    基本的な事の質問なのですが、まずSDS-PAGEで電気泳動する前に、私はサンプルを熱処理(お湯で溶かす)します。例えば免沈したサンプルをー20℃で冷凍保存したものを溶かすとき。 サンプル中の蛋白はSDSで変性させてると思うのですが、さきほど言ったお湯で溶かす過程で後輩に 「お湯で溶かす事によって変性するんですか?」とか「熱いお湯で溶かして蛋白が変性するのは問題ないんですか」と聞かれました。 私も未熟者なので「・・・。」となってしまったのですが、その基本的な質問された部分を教えていただきたいです。SDSで変性させるのと熱変性する違いはあるのでしょうか? よろしくお願いします。

  • SDS-PAGEゲルのトラブル

    あるタンパク質を生体物質から私の研究室(かなり小規模な研究室なので聞ける人があまりいないのです。)では精製していて、随分以前からそのタンパク質が精製できているかどうかをSDS-PAGEゲル上で確認していました。 ところが、ここ1ヶ月ほど前からそのSDSーPAGEゲルの電気泳動結果がおかしいのです。。 例えば、 *本来あるはずの低分子タンパク質のバンドが薄くしか(もしくは全く)見えない。高分子領域にスメアがたくさん見える。 *本来サンプルがアプライされているはずのないレーンにスメアっぽいバンドがたくさん見える。(特に高分子領域に) *バンドはかなりスメアっぽく見える。(シャープなバンドではない。) あと気づいたことですが、泳動直後のゲルはかなり暖かくなっていました。 このような原因として何が考えられるでしょうか?本当に困っています。 ちなみに、私たちの研究室では、 *SDS-PAGEゲルは自作 ポリアクリルアミド、SDS等を水溶液にしたものが冷蔵庫にストックされていて(2.3ヶ月前に作られました)、その水溶液と常時調製している10%APS溶液そしてTEMDを混ぜ合わせて常に作っています。 *ローディングバッファー 半年ちょっと前に作られて冷蔵庫にストックされたものを使っています。 *泳動用バッファー 10倍のTrisベースのバッファーが常温でストックされているので、それを随時希釈して使っています。 *泳動条件 150V(電気泳動ユニットに異常は見られません。)

  • SDSの結晶が電気泳動の結果に及ぼす程度について

    SDS-PAGEでミオシン重鎖を分離しています。SDSサンプルバッファーでサンプルを作る際に、冷蔵庫からバッファーを出して、SDSの結晶が底にあったかもしれないのですが、そのまま作成し電気泳動をして、バンドが得られました。このような場合、SDSの濃度の影響はどのくらい重要なのでしょうか。サンプルを作る段階でこのようなことがあるとその結果の信頼性はかなり低いのでしょうか。よろしくお願いいたします。

  • SDS-PAGの泳動中発生する気体は何か?

    大学の実験でSDS-PAGEを行いました。そのときに、泳動中に発生した気体は何かと聞かれたのですが、分からなかったのですが。何なんでしょうか? 泳動バッファーは、25mMTrisと192mMGlycineと0.1%SDSを混ぜたものです。