PBMC、単球の分離

質問

分離したPBMCを洗っていくうちに、3×10の7乗個ぐらいの細胞がいなくなってしまいました。おそらくチューブの壁に張り付いてしまっているのだと思うのですが、このような時は、血清を入れないこと、Caを入れないことの他に気をつけるべき点があるのでしょうか？

また、このPBMCから、単球をプラスチックに貼り付けて分離しようと試みましたが、洗っても洗っても単球がはがれてきません。な、なぜ、、、
EDTAを加えたり、洗浄用のバッファーを冷やしたりしましたが、一向にはがれる様子がありません。
激しくフラスコをシェイクし,やっとのことではがせましたが、洗浄するとこれまた細胞一個たりとものこっていません。

10mlの血液から始めて、フィコールでPBMCを分離した時はたくさん細胞が取れたのに、洗ったり、分離したりしてるうちに最後には跡形もなく消えてしまうのです。

どなたかお助けください。

回答No.2

sachihappy777 · ベストアンサー

No.1です。投稿がとぎれてしまいまいた。申し訳ありません。
一般的なヒト単球分離方法ですが・・
１　PBMC　1～2×10の7乗個ほどをRPMI1640培地　　
　　（FCS10%加）に浮遊
　　培養フラスコにヒト非働化血清1mL加え培養面にな　　じませ4℃で30分以上放置する
　　滅菌PBSを0.2%EDTA-Na　5%FCSに調製し4℃保存

２　血清処理フラスコに細胞浮遊液を加え、37度　１
　　ｈ　CO2インキュベーターで培養
３　培養フラスコを振とうして、液を捨てる。（2回洗
　　浄を繰り返す）
４　滅菌PBS（キレート剤添加済み）5mLを加え4℃　30分　
５　冷却培養液で2回洗浄、液を回収。

以上が一般的な接着法による単球の分離です。

洗っていくうちにPBMCがチューブの壁にくっつくといったことは経験上ありませんでしたが、洗浄後の遠心時に底にペレットは見えていますか？
見えているのなら上清を捨てる際にデカントで捨てていませんか？

単球の分離の際に細胞を顕微鏡で観察していますか？

以上の点・及びプロトコールの違いがあれば教えてください。

お礼

丁寧にご回答いただき恐悦至極に存じます。

洗浄後にきれいなペレットにはならず、バキュームで慎重に上澄みを除いた後、タッピングすると少し液がにごる、といった感じです。1.5mlチューブにて遠心すると、細胞がベターっと壁にへばりついて、なかなか落ちません。

ひょっとしたら洗浄メジウムやPBSに血清を添加しないといけないのかもしれませんね。
教えていただいたプロトコールでもう一度トライしてみようと思います。

単球分離の際、細胞を顕微鏡で見ますと、形が「張り付いてますよー」って感じになって、のっぺりとしているのが分かります。トリプシンーEDTA使用時の様に、細胞が丸くなったりとかはしていません。何度洗おうが、しっかりくっついています。

使っているメジウムはCa無添加なので、キレートはいらないかなと思っていたのですが、一度お教え通り添加してみます。

ありがとうございました。

回答No.1

sachihappy777

同じくフィコールを用いてPBMCを分離しているものです。

PBMCから単球の分離はどのように行っておられますか？